[發明專利]快速鑒別貓腸道冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的HRM引物對、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010414528.9
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN111518955A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 叢鋒;肖麗;黃碧洪
• 申請（專利權）人: 廣東省實驗動物監測所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州本諾知識產權代理事務所(普通合伙) 44574
• 代理人: 朱彩霞

本發明提供一種快速鑒別貓腸道冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的HRM引物對、試劑盒及方法，屬于分子生物學檢測技術領域。本發明HRM引物對根據貓冠狀病毒FCOV全長基因29 000bp至29 500bp之間的序列設計得到的。進行一次反應即可通過不同形狀熔解曲線同時鑒定區分FECV和FIPV，為疾病的早期診斷及防控提供技術支持。

技術領域

本發明涉及一種用于快速鑒別貓腸道冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的HRM引物對、試劑盒及方法，屬于分子生物學檢測技術領域。

背景技術

貓冠狀病毒(Feline coronavirus，FCoV)為不分節段、單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、α冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)。FCoV有貓腸道冠狀病毒(Feline enteric coronavirus，FECV)和貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis viruses，FIPV)兩個生物型。雖然大部分感染FCoV的貓患輕微腸炎或無癥狀，但仍有12％的貓會發展成為貓傳染性腹膜炎(FIP)，而FIP致死率高。

現有檢測FECV和FCoV的實驗方法主要是PCR法，包括普通PCR和熒光定量PCR，還有間接免疫熒光法和ELISA方法。PCR技術由于檢測靈敏度高，適用范圍廣，操作簡便等原因應用廣泛。但PCR檢測技術程序復雜、需要精密的儀器、檢測時間較長，不利于非實驗室環境下現場檢測以及基層實驗室的推廣應用。

高分辨率熔解曲線(High-resolution melting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態熔解曲線的基因突變掃描和基因分型的遺傳學分型方法，其基本原理是雙鏈核苷酸(double strand DNA，dsDNA)的熱穩定性受其長度和堿基組成的影響，序列變化會導致升溫過程中dsDNA解鏈行為的改變，所用的飽和熒光染料只能嵌入并結合到dsDNA上，因此利用實時熒光PCR技術，通過實時檢測dsDNA熔解過程中熒光信號值的變化，就能以生成不同形狀熔解曲線的方式將PCR產物中存在的差異直觀地展示出來。其敏感性極高、無需使用序列特異性探針就可以檢測出單個堿基的差異、PCR產物無需后處理(如酶切、電泳等)，可實現真正的閉管操作從而降低污染風險，已發展成為SNP基因分型、點突變篩查、物種鑒別等的重要手段。

目前，還沒有用HRM方法鑒別FECV和FIPV的相關報道。因此，建立貓腸道冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的HRM檢測方法很有必要。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明提供一種快速鑒別貓腸道冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的HRM引物對、試劑盒及方法。

本發明選取特定基因序列來設計一對HRM引物，通過不同形狀熔解曲線同時鑒定區分FECV和FIPV，為疾病的早期診斷及防控提供技術支持。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種快速鑒別貓腸道冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的HRM引物對，所述引物對上、下游引物序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：

FECV-FIPV-F:5′-CTATGTGAAGTACTGTCCAC-3′(SEQ ID No.1)；

FECV-FIPV-R:5′-GTGAGGTCTGTCGAAGACCT-3′(SEQ ID No.2)。

所述引物對根據貓冠狀病毒FCOV全長基因29 000bp至29 500bp之間的序列設計得到的。

本發明還提供一種快速鑒別貓腸道冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的HRM試劑盒，包含上述的引物對。

所述的HRM試劑盒，還包括其他HRM反應所需試劑：酶、熒光染料、Buffer等；