[發明專利]一種ELISA檢測試劑盒的構建方法、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202010414079.8
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN111562378A
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 代麗萍;王猛;劉峰輝;歐陽松云;王雨林;趙春玲;劉曼
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/543
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明屬于標志物及其檢測技術領域，公開了一種ELISA檢測試劑盒的構建方法、試劑盒及應用，進行包被液1L配制，10XPBST洗液1L配制，1X PBST洗液1L配制，封閉液配制，抗體稀釋液配制，McIvain`s buffer配制，顯色液配制，0.5M磷酸鹽緩沖液配制。本發明驗證EGFR能夠引起機體產生免疫反應并使機體產生相應的自身抗體，成本低、特異度高、敏感度強、準確性高、無創傷，可以作為早期肺癌的診斷生物標志物，用于區別肺癌患者和正常人，對不同類型肺癌患者與正常對照組進行鑒別；EGFR自身抗體對早期肺癌亦具有診斷價值，可與臨床指標CEA聯合進而提高肺癌診斷準確性。

技術領域

本發明屬于肺癌診斷的標志物及其檢測技術領域，尤其涉及一種ELISA檢測試劑盒的構建方法、試劑盒及應用。

背景技術

目前，肺癌是最常見惡性腫瘤之一，是全世界發病率與死亡率最高的惡性腫瘤，每年約有180萬新的肺癌病例發生，約占全部癌癥診斷的13％。近年來發病率呈現升高趨勢，肺癌起病隱匿并且早期無明顯臨床癥狀、病程發展快，通常確診時已為中晚期而錯過最佳治療時機，預后較差。目前臨床主要聯合影像學和“金標準”病理細胞技術診斷肺癌，由于早期確診率和靈敏度低、費用高、有創等缺點均不適合肺癌早期的篩查診斷。因此，在癌癥早期就表現出來異常的生物標志物受到高度重視。目前，臨床上用于肺癌檢測的標志物有CA125(糖抗原125)，CEA(癌胚抗原)，NSE(神經元烯醇化酶)，CYFRA211(細胞角蛋白19片段)等，這些指標主要用于肺癌預后評價和術后監測，對于肺癌診斷的靈敏度和特異性不高，所以至今尚無理想的可用于早期肺癌的診斷標志物。

癌癥發生后，腫瘤相關抗原能夠激活人體的細胞和體液免疫反應，產生相應的自身抗體，這些激活人體免疫系統的抗原稱為腫瘤相關抗原(Tumor associated antigens,TAAs)。但是，腫瘤相關抗原在血清中易被清除或降解，所以對肺癌早期診斷敏感性較低。與之相反，針對腫瘤相關抗原的自身抗體能夠在腫瘤患者血清中穩定存在并可以在出現癥狀數月甚至數年之前就可以被檢測到,因此，腫瘤相關抗原自身抗體，是發展無創血清學檢測、診斷和早期檢測癌癥的理想標志物。與傳統的抗原類標志物相比，自身抗體腫瘤標志物有天然的高特異性與免疫生物放大信號等獨特優勢，已經成為腫瘤早期診斷臨床應用技術的發展趨勢。杭州凱保羅生物科技有限公司推出了七種自身抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)用于肺癌檢測，但該產品主要應用于肺結節患者甄別良惡性，但是不足之處在于凱保羅試劑盒并不能達到很高的靈敏度和特異度且成本較高，不適合大批量應用于肺癌早期篩查和診斷，目前臨床尚無用于肺癌早期檢測的自身抗體診斷標志物。

因此，為了能夠提高肺癌早期診斷率和提高肺癌患者的生存率，需要研發新的靈敏度和特異度更高的自身抗體標志物，替代或聯合現有傳統標志物，從而提高肺癌的準確性。

綜上所述，現有技術存在的問題是：現有臨床上使用傳統的腫瘤標志物常用于肺癌預后評價和術后監測，不能用于肺癌的早期診斷。已報道的用于肺癌診斷的自身抗體對腫瘤診斷的靈敏度和特異度普遍偏低，對肺癌診斷意義不大，不適用于大批量應用于肺癌早期篩查和診斷。

解決上述技術問題的難度：到目前為止，還未有理想的可供臨床使用的肺癌早期篩查和診斷標志物。研發一種新的靈敏度和特異度較高的自身抗體標志物，需要經過大樣本量的試驗和驗證，以及運用正確的統計學分析方法和流行病學指標對標志物的診斷價值進行評價，以上都需要嚴謹的實驗設計，配套的儀器設備和深厚的專業知識背景。

解決上述技術問題的意義：發現一種新的可用于在肺癌早期時診斷的自身抗體，提前發現腫瘤不但可以以減少后期癌癥病人的痛苦，還可以降低病人后期治療的經濟負擔，并達到臨床對腫瘤“早發現，早治療，早康復”的要求，此外，將自身抗體和臨床指標聯合大大提高了臨床指標對肺癌診斷的靈敏度和特異度。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種一種ELISA檢測試劑盒的構建方法、試劑盒及應用，旨在解決現有肺癌腫瘤標志物不理想的問題，提高肺癌早期診斷的靈敏度、特異度和準確性。