[發明專利]一種診斷標志物及其在COVID-19診斷及冠狀病毒既往感染檢測中的應用

在審

• 申請號: 202010413901.9
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN113671190A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 陶生策;李陽;賴丹昀;江何偉;張海南;祁環
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

1.一種COVID-19的診斷標志物，其特征在于，所述診斷標志物包括肽段COVID19-V004，所述肽段COVID19-V004的氨基酸序列為：包含NRALTGIAVEQDKNTQEV中5個及5個以上連續氨基酸的序列；或

所述肽段COVID19-V004的氨基酸序列為：包含NRALTGIAVEQDKNTQEV中1個到幾個氨基酸的取代或/和缺失或/和添加所形成的序列。

2.根據權利要求1所述的COVID-19的診斷標志物，其特征在于，所述肽段的氨基酸序列為NRALTGIAVEQDKNTQEV，或包含氨基酸序列NRALTGIAVEQDKNTQEV中1個或幾個氨基酸的缺失或突變所形成的序列。

3.一種用于COVID-19的診斷試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-2任一項所述的診斷標志物。

4.一種檢測SARS-CoV-2病毒既往感染的檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-2任一項所述的診斷標志物。

5.根據權利要求3或4所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷標志物通過SMCC與BSA偶聯，形成SMCC-BSA-肽偶聯產物。

6.根據權利要求3或4所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準品、包被緩沖液、封閉液、樣品稀釋液、終止液、酶標試劑、酶底物溶液和洗滌液。

7.根據權利要求3或4所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述標準品包括抗診斷標志物(肽段COVID19-V004)的IgG抗體的濃度為0U/mL的標準血清1和抗診斷標志物(肽段COVID19-V004)的IgG抗體的濃度為100U/mL的標準血清2；所述標準血清1為正常人血清，標準血清2為COVID19-V004抗體為陽性的血清；

所述肽段COVID19-V004抗原采用包被緩沖液稀釋，所述包被緩沖液為0.05±0.005M、pH 9.6±0.05的碳酸鹽緩沖液，即每1L溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃；

所述封閉液為含3％牛血清白蛋白的0.01±0.005M、pH 7.4±0.05的磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液，即每1L中含有5g牛血清白蛋白(BSA)，8g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KCl。

8.根據權利要求3或4所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述酶底物溶液包括：顯色劑A：500mL溶液中含醋酸鈉13.6g，檸檬酸1.6g，30％雙氧水0.3mL；顯色劑B：500mL溶液中含TMB350mg，DMSO 20mL，檸檬酸·H₂O 5.1g。

9.根據權利要求3或4所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述標準品與待測血清樣品采用樣品稀釋液進行稀釋，所述樣品稀釋液為0.01M pH 7.4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)；

所述洗滌采用的洗滌液為含0.05％Tween-20的、0.01±0.005M、pH 7.4±0.05磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBST)，即每1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2gKCl，0.5mL Tween-20；

所述終止液為2±0.1M H₂SO₄溶液；

所述酶標試劑為含有辣根過氧化物酶標記的anti-Human IgG抗體的酶標試劑。

10.一種定性檢測人血清中抗肽段COVID19-V004的IgG抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、將權利要求1所述的診斷標志物肽段COVID19-V004通過SMCC與BSA偶聯；

B、將偶聯后的肽段COVID19-V004通過稀釋后包被在酶標板上的微孔內制成固相抗原，加入封閉液；

C、將標準品與待測血清樣品稀釋后加入各自的抗原測定孔中，溫育后，每孔加入含有辣根過氧化物酶標記的anti-Human IgG抗體的酶標試劑，形成COVID19-V004-抗體-酶標二抗復合物；

D、經步驟C處理后，徹底洗滌，加酶底物溶液顯色，然后加入終止液終止反應，通過OD₄₅₀值即得樣品中抗肽COVID19-V004的IgG抗體的水平。