[發(fā)明專利]基于結(jié)構(gòu)光照明的雙光子光場(chǎng)超分辨顯微成像方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010410734.2
• 申請(qǐng)日: 2020-05-15
• 公開（公告）號(hào): CN111693496A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范靜濤;周逸亮;吳嘉敏;戴瓊海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G06T3/40
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 石茵汀

本發(fā)明公開了一種基于結(jié)構(gòu)光照明的雙光子光場(chǎng)超分辨顯微成像方法，包括以下步驟：在雙光子顯微成像的過程中，對(duì)像面共軛面小孔處進(jìn)行0/1光強(qiáng)調(diào)制；通過結(jié)構(gòu)光照明方式逐點(diǎn)掃描成像過程中照射在樣本上的光斑；利用探測(cè)器采集光斑圖案，并對(duì)所述光斑圖案進(jìn)行解卷積處理，獲得超高數(shù)值孔徑衍射極限的超分辨圖像。該方法不受寬場(chǎng)探測(cè)的成像過程所限，可避免地存在高低頻信息混疊、受信噪比影響大的現(xiàn)象，無需以成像時(shí)間和計(jì)算量為代價(jià)，即可重構(gòu)出超分辨率圖像。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物光子計(jì)算顯微成像技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種通過結(jié)構(gòu)光照明獲得突破衍射極限的超分辨顯微成像技術(shù)。

背景技術(shù)

相較于傳統(tǒng)的二維顯微成像技術(shù)，光場(chǎng)顯微成像(Light Field Microscopy,LFM)通過記錄更高維度的光線信息，提高了顯微成像的景深，對(duì)樣本實(shí)現(xiàn)了三維重構(gòu)，故而在生物光學(xué)顯微成像領(lǐng)域占據(jù)一席之地。然而，傳統(tǒng)光場(chǎng)顯微成像系統(tǒng)的三維重構(gòu)能力是建立在橫向分辨率的犧牲上的—為了獲得入射光或出射光的角度信息，物鏡的數(shù)值孔徑被分割利用，探測(cè)器獲得原始圖案的分辨率也因此受限于低數(shù)值孔徑所對(duì)應(yīng)的衍射極限。結(jié)合傅里葉層疊顯微成像關(guān)于合成光學(xué)孔徑的思想，光場(chǎng)顯微可以在點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)先驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過解卷積獲得近物鏡全數(shù)值孔徑對(duì)應(yīng)衍射極限的橫向分辨率；而在該過程中，采用低數(shù)值孔徑合成高數(shù)值孔徑的思想也同時(shí)為高于照明光空間頻率的高頻調(diào)制的引入提供了便利和可能。

雙光子顯微(2Ps)作為多光子顯微成像的一種，以其長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)的特點(diǎn)以及非線性吸收的性質(zhì)，對(duì)散射具有更強(qiáng)的魯棒性，因此成為實(shí)現(xiàn)更深層組織成像的重要方式。從分辨率的角度上來說，雙光子吸收對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)平方在理論上能使橫向分辨率得到一定程度上的提高，但實(shí)際應(yīng)用中由于噪聲等不可避免因素的存在，分辨率的變化往往不大明顯。將雙光子顯微與上述光場(chǎng)顯微的技術(shù)結(jié)合起來，可以在提高穿透深度的同時(shí)保證空間分辨率的穩(wěn)定，但能得到的成像分辨率仍然基本受限于大數(shù)值孔徑對(duì)應(yīng)的衍射極限，無法實(shí)現(xiàn)分辨率的進(jìn)一步突破。

結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(Structure Illumination Microscopy,SIM)作為突破衍射極限的重要方法，在超分辨成像領(lǐng)域備受科研工作者關(guān)注。通過引入不同相位、不同角度的照射光強(qiáng)調(diào)制，結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)將樣本原本超衍射極限的不可分辨信息搬移至物鏡的數(shù)值孔徑內(nèi)，經(jīng)過后期求解，最高可獲得兩倍數(shù)值孔徑所對(duì)應(yīng)的橫向分辨率?？梢钥闯?，為了獲得超分辨率圖像，傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)難以避免地意味著更慢的成像速度以及更大的計(jì)算量。

飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(Saturated Structured Illumination Microscopy,SSIM)是將結(jié)構(gòu)光照明顯微與雙光子成像相結(jié)合的真正超分辨技術(shù)。利用雙光子的光強(qiáng)平方關(guān)系以及熒光分子的光強(qiáng)飽和性質(zhì)，飽和結(jié)構(gòu)光照明僅僅通過引入對(duì)照射光強(qiáng)的適當(dāng)提高，就可在頻域上將更高頻的樣本信息搬移至物鏡的數(shù)值孔徑內(nèi)。該方法能獲得的最高分辨率在理論上僅受限于系統(tǒng)噪聲，盡管為獲得高頻的信息所需付出的時(shí)間和計(jì)算量是成倍增加的。

結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(SIM)作為突破衍射極限的重要方法，在超分辨成像領(lǐng)域備受科研工作者關(guān)注。通過引入不同相位、不同角度的照射光強(qiáng)調(diào)制，結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)將樣本原本超衍射極限的不可分辨信息搬移至物鏡的數(shù)值孔徑內(nèi)，經(jīng)過后期求解，最高可獲得兩倍數(shù)值孔徑所對(duì)應(yīng)的橫向分辨率。可以看出，為了獲得超分辨率圖像，傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)難以避免地意味著更慢的成像速度以及更大的計(jì)算量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。

為此，本發(fā)明的目的在于提出一種基于結(jié)構(gòu)光照明的雙光子光場(chǎng)超分辨顯微成像方法，該方法能在成像時(shí)間和計(jì)算量未有增加的前提下，以較為簡(jiǎn)單的方式獲得兩倍超分辨率圖像以及無窮分辨率圖像。