[發(fā)明專利]一種靶向CD45的打靶載體及其整合至CD45外顯子1位點(diǎn)的方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010410284.7
• 申請(qǐng)日: 2020-05-15
• 公開（公告）號(hào): CN111607611A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盛劍鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 乾元康安（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32267
• 代理人: 石磊

本發(fā)明公開了一種靶向CD45的打靶載體及其整合至CD45外顯子1位點(diǎn)的方法和應(yīng)用，本發(fā)明找到了CD45中一個(gè)新的能實(shí)現(xiàn)靶向整合的位點(diǎn)序列，利用該位點(diǎn)可構(gòu)建靶向插入外源基因的打靶載體，并驗(yàn)證了利用該打靶載體能高效整合外源基因至CD45基因位點(diǎn)，后續(xù)得到的靶向插入外源基因的CD45?DTR BAC，可以用于構(gòu)建靶向插入外源基因的小鼠胚胎干細(xì)胞，從而為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及小鼠建立了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及靶向打靶載體及靶向整合外源基因至CD45外顯子1位點(diǎn)的方法和應(yīng)用。

技術(shù)背景

通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合至靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的，這種技術(shù)稱為基因打靶技術(shù)。利用基因打靶技術(shù)將外源基因靶向整合至特定的染色體位點(diǎn)在基因療法、細(xì)胞工程、遺傳動(dòng)物模型、基因功能研究及藥物開發(fā)等中具有重要應(yīng)用價(jià)值，而所有這些應(yīng)用一方面依賴于轉(zhuǎn)入基因功能的可靠性和可預(yù)測(cè)性，另一方面要求轉(zhuǎn)入基因不影響內(nèi)源基因和或其他調(diào)控因子的功能。CD45是一種主要表達(dá)于免疫細(xì)胞表面的信號(hào)分子，所以CD45可以作為一個(gè)基因敲入的位點(diǎn)，使外源基因在免疫細(xì)胞中特異性表達(dá)，在其他細(xì)胞中不表達(dá)。目前針對(duì)CD45的基因敲除技術(shù)中，為了保證同源重組的效率需要長(zhǎng)片段的同源臂，而直接克隆長(zhǎng)片段的同源臂較為困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，將需要靶向插入的外源基因利用短同源臂先導(dǎo)入相應(yīng)的BAC克隆，然后提取BAC進(jìn)一步作為基因打靶的載體，以提高基因打靶的效率，而且我們把插入位點(diǎn)設(shè)置在CD45外顯子1位點(diǎn)，并利用IRES啟動(dòng)外源基因表達(dá)，最小化外源基因插入對(duì)細(xì)胞功能的影響。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種靶向CD45的打靶載體，所述打靶載體包含與CD45基因5’端和3’端同源的5’端同源臂和3’端同源臂，以及在5’端同源臂和3’端同源臂之間的外源基因，真核細(xì)胞啟動(dòng)子，原核細(xì)胞啟動(dòng)子和篩選標(biāo)志物。

進(jìn)一步的，上述一種靶向CD45的打靶載體，所述打靶載體靶向整合外源基因至CD45基因位點(diǎn)，所述基因位點(diǎn)范圍位于小鼠一號(hào)染色體138062859-138175756之間或人一號(hào)染色體198638968-198757476之間。

進(jìn)一步的，上述一種靶向CD45的打靶載體，所述打靶載體包含從左到右依次為5’端同源臂、IRES基因、外源基因、真核細(xì)胞啟動(dòng)子，原核細(xì)胞啟動(dòng)子、篩選標(biāo)志物和3’端同源臂的這部分序列。

進(jìn)一步的，上述一種靶向CD45的打靶載體，所述外源基因?yàn)榭商鎿Q的，包括但不限于選用DTR基因。

進(jìn)一步的，上述一種靶向CD45的打靶載體，所述5’端同源臂的序列為SEQ IDNO.3，所述3’端同源臂的序列為SEQ ID NO.13。

進(jìn)一步的，上述一種靶向CD45的打靶載體，所述打靶載體的序列如SEQ ID NO.14所示。

進(jìn)一步的，上述靶向CD45的打靶載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)以RP23-180D23 BAC DNA為模板，利用序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物進(jìn)PCR，擴(kuò)增出序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段CD45的5’端同源臂；

(2)將目的基因片段CD45 5HA利用酶切位點(diǎn)KpnI、SalI克隆至帶陽性選擇標(biāo)記的載體pL451-targeted-empty，得到中間載體pL451-CD45 5HA-PEN；