[發(fā)明專利]一種靶向CD45的打靶載體及其整合至CD45外顯子1位點(diǎn)的方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010410284.7
• 申請(qǐng)日: 2020-05-15
• 公開（公告）號(hào): CN111607611A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盛劍鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 乾元康安（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32267
• 代理人: 石磊

1.一種靶向CD45的打靶載體，其特征在于，所述打靶載體包含與CD45基因 5’端和3’端同源的5’端同源臂和3’端同源臂，以及在5’端同源臂和3’端同源臂之間的外源基因，真核細(xì)胞啟動(dòng)子，原核細(xì)胞啟動(dòng)子和篩選標(biāo)志物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向CD45的打靶載體，其特征在于，所述打靶載體靶向整合外源基因至CD45基因位點(diǎn)，所述基因位點(diǎn)范圍位于小鼠一號(hào)染色體138062859-138175756之間或人一號(hào)染色體198638968-198757476之間。

3.根據(jù)權(quán)利要1所述的一種靶向CD45的打靶載體，其特征在于，所述打靶載體包含從左到右依次為5’端同源臂、IRES基因、外源基因、真核細(xì)胞啟動(dòng)子，原核細(xì)胞啟動(dòng)子、篩選標(biāo)志物和3’端同源臂的這部分序列。

4.根據(jù)權(quán)利要3所述的一種靶向CD45的打靶載體，其特征在于，所述外源基因?yàn)榭商鎿Q的，包括但不限于選用DTR基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種靶向CD45的打靶載體，其特征在于，所述5’端同源臂的序列為SEQ ID NO.3，所述3’端同源臂的序列為SEQ ID NO.13。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種靶向CD45的打靶載體，其特征在于，所述打靶載體的序列如SEQ ID NO.14所示。

7.如權(quán)利要求6所述的靶向CD45的打靶載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1) 以RP23-180D23 BAC DNA為模板，利用序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物進(jìn)PCR，擴(kuò)增出序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段CD45 的5’端同源臂；

(2) 將目的基因片段CD45 5HA利用酶切位點(diǎn)KpnI、SalI克隆至帶陽性選擇標(biāo)記的載體pL451-targeted-empty，得到中間載體pL451-CD45 5HA-PEN；

(3) 以pLVX-EF1α-IRES-mCherry 質(zhì)粒為模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段IRES；以pIRES-proHB EGF WT 質(zhì)粒為模板，利用序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出序列如SEQ ID NO.9所示的基因片段DTR；Overlap PCR得到序列如SEQ ID NO.10所示的融合基因片段IRES-DTR；

(4) 將目的基因片段IRES-DTR利用酶切位點(diǎn)SalI、EcoRI克隆至中間載體pL451-CD455HA-PEN，得到中間載體pL451-CD45 5HA-IRES-DTR-PEN；

(5) 以RP23-180D23 BAC DNA為模板，利用序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出序列如SEQ ID NO.13所示的基因片段CD45 的3’端同源臂；

(6) 將目的基因片段CD45 3HA利用酶切位點(diǎn)BamHI、NotI克隆至中間載體pL451-CD455HA-IRES-DTR-PEN，得到序列如SEQ ID NO.14所示的打靶載體PL451-loxP IRES-DTR CD453HA 5HA。