[發明專利]融合DNA聚合酶突變體及其在等溫擴增中的應用

在審

• 申請號: 202010394538.0
• 申請日: 2020-05-11
• 公開（公告）號: CN113637085A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 馬陳翠;姚永豪;崔崧;于繼彬
• 申請（專利權）人: 蘇州先達基因科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/12;C12Q1/6844
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫周強

本發明公開了一種融合DNA聚合酶突變體及其在等溫擴增中的應用，為來自基于Bacillus stearothermophilus的DNA聚合酶改造的突變體或衍生物，野生型DNA聚合酶中，定點氨基酸突變的位點和氨基酸為Arg⁵⁹⁶、Asp⁵⁹⁸、Gly⁶⁰⁰、Ile⁷¹⁶、Asp⁷¹⁸、Try⁷¹⁹中的兩種或多種，稱之為新型融合DNA聚合酶突變體，所述新型融合DNA聚合酶突變體具有高鏈置換活性的優點，在恒溫條件下即可加速解開DNA雙螺旋結構，解鏈效率更高，用于恒溫擴增時其實現目標基因的高效快速復制，用于核酸擴增檢測速度更快，效率更高。

技術領域

本發明屬于DNA聚合酶突變及其擴增技術，具體涉及一種新型融合高解鏈擴增性能的DNA聚合酶突變體或衍生物，及其在鏈置換等溫擴增中的應用。

背景技術

以聚合酶鏈反應（PCR）擴增為基礎的分子診斷在特異性、靈敏度和檢測時間方面可以滿足必要的診斷要求；但其涉及多個操作步驟，需要具有較強操作技能的專業技術人員來進行樣品制備，DNA擴增和檢測。另外，PCR需要精確的熱循環儀來進行PCR反應。而等溫核酸擴增技術與傳統的聚合酶鏈反應相比不需要熱循環，更適合在特定的恒定溫度下進行即時檢測，等溫核酸擴增代表了一種極具潛力的技術，該技術可以針對傳染病提供快速，靈敏和特定的分子診斷 (Caliendo AM, 2013)。在絕大多數基于恒溫擴增方法中，有效的靶標擴增取決于擴增步驟中使用的DNA聚合酶的固有鏈置換活性 (Craw P, 2012) (Gill P,2008)。鏈置換反應是指一種DNA聚合酶在延伸新鏈的過程中如果遇到下游DNA鏈，可以繼續延伸反應并同時將下游雙鏈剝離而產生游離的單鏈，這種鏈置換能力替代了傳統上通過物理高溫實現的雙鏈解離。等溫擴增以其獨特的自身優勢開辟了廣闊的市場。DNA聚合酶基于其氨基酸序列和結構同源性已被分為七個家族（A，B，C，D，X，Y，RT） (Burgers PM, 2001)。這些不同的家族具有執行其在核酸代謝中不同生物學作用所需的獨特結構和功能特性；其中A家族DNA聚合酶主要存在于原核生物中，來自原核生物的DNA聚合酶I就屬于該家族。DNA聚合酶I高解析度的晶體結構已經被確定包括Taq聚合酶I (Kim, 1995) (Li, 1998)，大腸桿菌聚合酶I (Beese, 1993) (Ollis, 1985)，Bst聚合酶 (Kiefer, 1998)和噬菌體T7DNA聚合酶 (Doublie, 1998)，它的結構可以用人的右手來描述，具有三個子域，分別稱為拇指（thumb），手指（finger）和手掌（palm）。手指（finger）亞域主要功能是結合剛進入的核苷酸和與單鏈模板相互作用，手掌（palm）亞域催化氨基酸殘基和結合剛進入的dNTP，拇指（thumb）亞域則結合雙鏈DNA。

一種具有高聚合活性和高鏈置換活性的DNA聚合酶對于等溫核酸擴增是非常關鍵的，然而目前只能選擇那些具有固有鏈置換活性的DNA聚合酶，這些酶能夠在特定溫度下進行DNA合成，但是對于其擴增聚合能力和DNA鏈置換能力方面仍有待改善。

發明內容

野生型來自Bacillus stearothermophilus的Bst DNA聚合酶I因其最適溫度在60℃左右和固有的鏈置換活性而被廣泛用于等溫擴增，并且在臨床快速檢測病毒感染中起著關鍵作用。與其他DNA聚合酶I類似，Bst DNA聚合酶I有三個獨立的子域，分別執行生物學功能：（I）5'-3'核酸外切酶活性（位于N端），（II）5'-3'DNA聚合酶活性（位于C端）和（III）3'-5'核酸外切酶活性。結構域II和III位于Bst DNA聚合酶的C末端，稱為大片段（LargeFragment, LF）。由于Bst DNA聚合酶滿足高靈敏度，聚合活性和熱穩定性的所有要求，因此已被廣泛應用于快速檢測的等溫擴增過程中，但是效率以及鏈置換能力還需要進一步提升。

本發明采用如下技術方案：