[發明專利]一種提高膜片鉗實驗效率的方法

有效

• 申請號: 202010392323.5
• 申請日: 2020-05-11
• 公開（公告）號: CN111748514B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 李志遠;湯鳳;徐浚杰;田超;劉雨杰;黃榮奇
• 申請（專利權）人: 廣州浚遠康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 胡素麗;劉明星

本發明公開了一種提高膜片鉗實驗效率的方法，包括以下步驟：用基質膠包被細胞培養板，得到基質膠包被的細胞培養板，將細胞復蘇后進行傳代培養，將傳代培養的細胞接種至基質膠包被的細胞培養板中培養，然后將DNA或質粒轉染至細胞中，將轉染后的細胞加入到玻片上培養后用于膜片鉗實驗。本發明的方法使得上樣時細胞平均存活時間增加了200％?400％，顯著地提高了膜片鉗實驗效率。

技術領域：

本發明屬于電生理膜片鉗技術領域，具體涉及一種提高膜片鉗實驗效率的方法。

背景技術：

膜片鉗技術是一種記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜上離子通道分子活動的技術。是用來研究單個離體的活細胞、組織切片或細胞膜片離子流的電生理實驗技術。這項技術在可興奮細胞如神經元、心肌細胞、肌纖維和胰腺細胞的研究中起至關重要的作用，也可用于研究特殊制備的巨型球狀體中的細菌離子通道。

傳統膜片鉗技術對實驗人員的技術要求非常高，一般地，實驗人員需要經過嚴格的長期的訓練，才能準確且快速的操作。雖然早在2004年，已經發明出了全自動膜片鉗，操作簡單，易掌握，通量高(是傳統膜片鉗的數十倍)。但是全自動膜片鉗只適用于藥物的初篩和二次篩選，且對樣本有很高的選擇性，而傳統的膜片鉗技術可適用于各種樣本，應用范圍廣，能夠分析檢測所有的離子通道類型，同時能夠分析離子通道的動力學特征。因此目前，傳統膜片鉗技術仍然是不可替代的。

在進行膜片鉗實驗時，玻璃電極尖端給負壓并吸住細胞，形成高阻封接，破膜，給藥，記錄數據的過程，都需要細胞保持最好的活性狀態，才能更加高效的獲得有效數據。因此細胞的穩定性就成了評估樣品好壞的關鍵。

在傳統膜片鉗實驗中，樣品準備是非常關鍵的步驟，細胞也即樣品狀態的好壞，直接決定了實驗效率。在研究各種離子通道時，實驗人員最常使用的工具細胞有HEK293T細胞系。

1973年，最原始的HEK293細胞來源于一個夭折的人類胚胎腎細胞中。將人的胚胎腎細胞中轉化入人5型腺病毒DNA片段，得到的細胞即為HEK293細胞。293細胞中轉入SV40T-antigen基因形成的高轉衍生株，即為293T細胞系。這使得包含SV40ori的質粒能夠在該細胞系中顯著擴增，從而促進表達載體的擴增，促進蛋白的表達。HEK293T細胞易于轉染，且能短時間內快速表達蛋白。

綜上所述，傳統膜片鉗是電生理領域最重要的實驗技術，但是因為操作難度極高和實驗效率低下的原因，嚴重影響了傳統膜片鉗充分發揮其作用。

發明內容：

本發明旨在提供一種提高膜片鉗實驗效率的方法，從而顯著地提高實驗效率的目的。該方法可提高2-5倍的實驗效率，使獲得實驗數據更加穩定和高效。

為達到上述目的，本發明采用技術方案為：

一種提高膜片鉗實驗效率的方法，包括以下步驟：用基質膠包被細胞培養板，得到基質膠包被的細胞培養板，將細胞復蘇后進行傳代培養，將傳代培養的細胞接種至基質膠包被的細胞培養板中培養，然后將DNA或質粒轉染至細胞中，將轉染后的細胞加入到玻片上培養后用于膜片鉗實驗。

具體步驟如下：將基質膠加入到預冷的無血清的DMEM/F12培養基中，混勻后加入到細胞培養板中孵育，得到基質膠包被的細胞培養板，將細胞復蘇后接種到含有10％胎牛血清的DMEM培養基中進行傳代培養，將傳代培養的細胞接種至添加有含有10％胎牛血清的DMEM培養基的基質膠包被的細胞培養板中培養，待細胞融合密度達到60％-70％時，將DNA或質粒轉染至細胞中，將轉染后的細胞用胰酶消化，離心收集細胞，加入含有10％胎牛血清的DMEM培養基重懸，將重懸后的細胞加入到玻片上培養后用于膜片鉗實驗。

進一步地，所述的基質膠與預冷的無血清的DMEM/F12培養基的添加比為1:100～200。

進一步地，所述的細胞為HEK293T細胞。