[發明專利]一種組織塊酶聯合法培養人皮膚成纖維細胞的方法

在審

• 申請號: 202010380454.1
• 申請日: 2020-05-08
• 公開（公告）號: CN111647550A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 陳霖;康爽明;王陽;胡嬋娟;陳大為;齊娜
• 申請（專利權）人: 嘉禾弘生（深圳）健康產業集團有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京華際知識產權代理有限公司 11676
• 代理人: 葉宇

本發明公開了細胞培養技術領域，具體領域為一種組織塊酶聯合法培養人皮膚成纖維細胞的方法，其方法包括取樣、清洗消毒和皮膚處理等步驟，使用膠原酶與DNA酶Ⅰ的雙酶組合，可使組織塊適度消化，可以避免消化后離心帶來的細胞損傷，提高細胞活率及貼壁率，又可避免傳統貼壁法細胞培養周期較長的缺陷，使用HPL(人血小板裂解提取物)替代FBS(胎牛血清)在較大程度上提高臨床應用的安全性，本方法無需去除表皮層，而是將表皮層貼壁培養以獲得更高產的細胞，利用差速消化法純化目的細胞。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，具體領域為一種組織塊酶聯合法培養人皮膚成纖維細胞的方法。

背景技術

人皮膚成纖維細胞是組成皮膚真皮的主要結構成分，其可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網狀纖維、透明質酸等細胞外基質，對于保持皮膚強度和彈性、修復損傷及美容美體具有重要作用。是維持皮膚年輕態的決定性因素，也是維持皮膚結構穩定的重要組成部分。人隨著年齡的增長，成纖維細胞數量和活性均呈下降趨勢，相應的其產生的膠原蛋白、彈性纖維、透明質酸等物質會逐漸減少，不足以支撐皮膚結構，導致真皮層變薄，皮膚開始出現松弛、失去彈性和出現皺紋等現象。補充人皮膚成纖維細胞能夠從根源上解決面部損傷及緩解皮膚衰老等問題，因此而備受醫療及美容界的關注。

現有分離純化皮膚成纖維細胞的方法主要是組織塊培養法和酶消化法，組織塊培養法主要是將新鮮皮膚組織洗凈、剪碎、離心，然后用培養基重懸培養；酶消化法主要是將新鮮皮膚組織洗凈、剪碎、胰酶消化、清洗，然后利用培養基重懸細胞進行培養。以上兩種方法存在如下缺點：

1、傳統成纖維細胞培養方法中使用酶消化后再離心收集細胞接種，對細胞有較大損傷，會導致原始種子細胞貼壁效率較低，從而影響初始細胞的產率；

2、傳統成纖維細胞培養方法中采用組織塊貼壁法，此技術的缺點是細胞爬出的時間較長，導致整個細胞培養周期較長；

3、傳統成纖維細胞培養方法中較多采用動物源性的FBS作為營養物質，因含有動物源性的成分，在臨床上是限制使用的；

4、傳統成纖維細胞培養方法中使用膠原酶和中性蛋白酶作為組合，但仍不能很好的解決細胞消化后黏連的問題；

5、傳統成纖維細胞培養方法中細胞總產量相對較低，較難滿足臨床使用需求；

6、傳統成纖維細胞培養方法中需完全去除表皮組織后再進行培養，操作過程繁瑣。

發明內容

本發明的目的在于提供一種組織塊酶聯合法培養人皮膚成纖維細胞的方法，以解決上述背景技術中提到的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種組織塊酶聯合法培養人皮膚成纖維細胞的方法，其方法包括以下步驟：

步驟1：取樣

采集耳后、臀部或大腿內側全皮層皮膚組織，其具體操作為使用利多卡因進行局部麻醉，使用取樣器材取耳后、臀部或大腿內側約1cm²全皮層皮膚組織，全皮層皮膚組織需要包含表皮層、真皮層及皮下組織，將取得的皮膚組織放置在含皮膚保存液A的離心管內，將離心管放置于溫度為2-8℃條件下保存；

步驟2：清洗消毒

采用清洗液將步驟1取得的皮膚組織進行清洗操作；

步驟3：皮膚處理

將步驟2清洗后的皮膚組織刮去皮下組織及脂肪，放置于含皮膚保存液B的離心管內，將離心管放置溫度為37℃的二氧化碳培養箱內過夜消化；

步驟4：接種