[發(fā)明專利]一種組織塊酶聯(lián)合法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010380454.1
• 申請日: 2020-05-08
• 公開（公告）號: CN111647550A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發(fā)明（設計）人: 陳霖;康爽明;王陽;胡嬋娟;陳大為;齊娜
• 申請（專利權）人: 嘉禾弘生（深圳）健康產業(yè)集團有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京華際知識產權代理有限公司 11676
• 代理人: 葉宇

1.一種組織塊酶聯(lián)合法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的方法，其特征在于：其方法包括以下步驟：

步驟1：取樣

采集耳后、臀部或大腿內側全皮層皮膚組織,將取得的皮膚組織放置在含皮膚保存液A的離心管內，將離心管放置于溫度為2-8℃條件下保存；

步驟2：清洗消毒

采用清洗液將步驟1取得的皮膚組織進行清洗操作；

步驟3：皮膚處理

將步驟2清洗后的皮膚組織刮去皮下組織及脂肪，放置于含皮膚保存液B的離心管內，將離心管放置溫度為37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱內過夜消化；

步驟4：接種

將步驟3中經(jīng)消化后的皮膚組織采用渦旋振蕩器震蕩8-12秒，將皮膚組織取出，放置于培養(yǎng)皿內，將表皮層與真皮層剝離開，將真皮層加入離心管內，加入生長培養(yǎng)基，吹打組織塊使其松散，將表皮層組織與真皮層組織分別接種至6孔板內；

步驟5：補液

將經(jīng)步驟4接種后的皮膚組織培養(yǎng)3天后，孔內均補加生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟6：換液

取出組織塊及培養(yǎng)液，用移液器吹打后，在1000rpm條件下離心5min，離心后的沉淀用新鮮生長培養(yǎng)基重懸后接種至6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換新鮮生長培養(yǎng)基，直至較多細胞較密集生長區(qū)域形成；

步驟7：原代傳代消化

吸棄原培養(yǎng)液，采用生理鹽水清洗含細胞的培養(yǎng)孔，每孔加入預溫的溫和消化酶，在二氧化碳培養(yǎng)箱內進行消化，當成纖維細胞大部分變圓脫落，上皮細胞基本未變形時，加入生長培養(yǎng)基終止消化，將消化下來的細胞吸走，將細胞在1000rpm條件下離心5min，離心后用新鮮生長培養(yǎng)基將細胞按照5500-6500個/cm²接種繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟8：傳代

當細胞融合度達75％-85％時進行細胞傳代，傳代后接種繼續(xù)培養(yǎng)直至需要的代數(shù)和數(shù)量。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種組織塊酶聯(lián)合法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的方法，其特征在于：步驟1中所述皮膚保存液A包括DMEM和體積分數(shù)為1％的雙抗。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種組織塊酶聯(lián)合法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的方法，其特征在于：步驟2中所述清洗液包括生理鹽水、體積分數(shù)為1％雙抗和160U/ml慶大霉素。

4.根據(jù)權利要求3所述的一種組織塊酶聯(lián)合法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的方法，其特征在于：步驟2中對皮膚組織的清洗次數(shù)為4-5。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種組織塊酶聯(lián)合法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的方法，其特征在于：步驟3中過夜消化時間為15-17h。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種組織塊酶聯(lián)合法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的方法，其特征在于：步驟3中所述皮膚保存液B包括DMEM、膠原酶、DNA酶Ⅰ、HPL和體積分數(shù)為1％的雙抗。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種組織塊酶聯(lián)合法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的方法，其特征在于：所述生長培養(yǎng)基包括DMEM、HPL和體積分數(shù)為1％的雙抗。