[發明專利]RT-RAA熒光法檢測SARS-CoV-2的引物、探針、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 202010374163.1
• 申請日: 2020-05-06
• 公開（公告）號: CN111518951B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 袁靜;薛冠華;李少麗;崔晶花;閆超;趙漢青;馮燕玲
• 申請（專利權）人: 首都兒科研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾;周達

1. 一種RT-RAA熒光法檢測SARS-CoV-2 的引物，其包括如SEQ ID NO.2所示序列的引物和如SEQ ID NO.3所示序列的引物：

5’- CTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATG -3’ （SEQ ID NO.2）；

5’- GTTGGTTGGACTCTAAAGTTAGAAGTTTGATAG -3’ （SEQ ID NO.3）。

2. 一種RT-RAA熒光法檢測SARS-CoV-2 的探針，其包括如SEQ ID NO.4所示序列的探針，或在SEQ ID NO.4所示序列基礎上經修飾的探針：

5’-CCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACG -3’（SEQ IDNO.4）；

其中，所述修飾為：

探針序列離5’端堿基數35bp的位置上的堿基T采用熒光報告基團FAM修飾，探針序列離5’端堿基數39bp的位置上的堿基T用熒光淬滅基團BHQ修飾，探針序列離5’端堿基數37bp的位置上的堿基T用四氫呋喃殘基（THF）替換。

3. 一種RT-RAA熒光法檢測SARS-CoV-2 的試劑盒，其包含：權利要求1所述的引物，和/或權利要求2所述的探針。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其中還包括RT-RAA基礎熒光通用反應試劑和反應緩沖液，所述緩沖液包括Tris-HCl緩沖液、MgAc和PEG10000。

5.根據權利要求3或4所述的試劑盒，其中還包括陽性質控品和陰性質控品。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其中，所述陽性質控品為含SARS-CoV-2的特異性基因序列，所述陰性質控品為不含SARS-CoV-2的特異性序列的RT-RAA擴增體系。

7.權利要求1所述的引物或權利要求2所述的探針或權利要求3-6中任一項所述的試劑盒在體外檢測樣品中是否存在新型冠狀病毒SARS-CoV-2的應用，所述應用為非診斷目的的。

8.根據權利要求7所述的應用，其中，所述引物在反應體系中的終濃度獨立地為0.42pM/μl，所述探針在反應體系中的終濃度為0.24pM/μl。

9. 根據權利要求8所述的應用，其中，反應體系中還包括RT-RAA基礎熒光通用反應試劑和反應緩沖液，所述反應緩沖液包括以下含量組分：濃度為450mM，pH 為7.6的Tris-HCl緩沖液、濃度為260mM的MgAc和10% W/V的PEG10000。

10.根據權利要求9所述的應用，其中，檢測包括以下步驟：

S1：提取待測樣品RNA；

S2：反應體系配制：將反應緩沖液加入到RT-RAA基礎熒光通用反應試劑中，使其充分溶解并混勻；加入已提取的待測樣品RNA為模板；

S3：將上述反應體系混勻，放入熒光檢測儀器中進行實時RAA熒光反應；所述實時RT-RAA熒光法反應條件為：反應溫度37-42℃，反應時間5～15min；

S4：根據熒光檢測儀器檢測到信號分析結果。

11. 根據權利要求10所述的應用，其中，步驟S2中，所述反應緩沖液包含使用濃度為450mM、pH 7.6的Tris-HCl 緩沖液；260mM的MgAc；10％W/V的PEG10000，終濃度為0.24pM/μl的探針，和終濃度分別為0.42pM/μl的上游引物和下游引物，余量為作為溶劑的水；

步驟S3中，所述實時RT-RAA熒光法反應條件為：反應溫度為39℃，反應時間為10min。