[發明專利]免疫細胞體外培養、誘導、激活、凍存方法及其細胞庫建立

有效

• 申請號: 202010371435.2
• 申請日: 2020-05-06
• 公開（公告）號: CN111454903B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 張炳強;陳夢夢
• 申請（專利權）人: 青島瑞思德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C40B50/06;A01N1/02
• 代理公司: 上海怡恩專利代理事務所(普通合伙) 31336
• 代理人: 牟俊玲

本發明公開了免疫細胞體外培養、誘導、激活、凍存方法及其細胞庫建立。該方法包括：利用免疫細胞專用擴增培養基將單個核細胞進行第一階段擴增培養，得到初步擴增的免疫細胞；利用免疫細胞專用誘導培養基將初步擴增的免疫細胞進行第二階段誘導和擴增培養，得到誘導的免疫細胞；利用免疫細胞專用激活培養基將誘導的免疫細胞進行第三階段激活和擴增培養，獲得大量的激活功能的免疫細胞；利用免疫細胞專用凍存液凍存免疫細胞，得到凍存的免疫細胞；按ABO/RH分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的免疫細胞信息檔案，構建免疫細胞庫。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及免疫細胞體外培養、誘導、激活、凍存的方法及其細胞庫建立的方法。

背景技術

細胞生物治療己經成為繼手術、放化療及內分泌治療之后的第五大治療模式。過繼性免疫細胞治療是細胞生物治療方法之一，它是指向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷腫瘤細胞或激發機體免疫反應來殺傷腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。目前臨床上應用的免疫細胞包括DC-CIK細胞、TIL細胞、LAK細胞及NK細胞，其中，CIK細胞、LAK細胞和NK細胞都是以自然殺傷細胞為主體的抗癌體系。

NK細胞又稱自然殺傷細胞(natural killer cell)，在人體全身巡邏的同時搜尋癌細胞及病毒感染細胞等并對其進行攻擊，在人體自然免疫中發揮著重要的作用。NK細胞占血液中淋巴細胞的10-30％，含穿孔素、顆粒酶等細胞毒性因子。NK細胞可釋放穿孔素、顆粒酶，穿孔素在靶細胞表面穿孔，使顆粒酶b進入靶細胞誘導靶細胞凋亡。NK細胞同時分泌大量的細胞因子，如ifn-v、tnf-x、gm-csf、il-3、m-csf等，直接作用于靶細胞，或通過進一步激活其他種類免疫細胞攻擊靶細胞。

NK細胞在腫瘤免疫、清除非己細胞等方面發揮重要作用：它是天然免疫防御的主要組成，位于機體防御體系的第一道防線，NK細胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，無需抗原預先致敏即可識別并殺死腫瘤及病毒感染的細胞，通過穿孔素-顆粒酶途徑和Fas-FasL通路直接對腫瘤細胞發揮細胞毒作用殺傷腫瘤細胞；同時它又能在發病早期分泌多種細胞因子和趨化因子如 TNF-α、IFN-γ和IL-1等，這些細胞因子參與抗癌和調節獲得性免疫應答，故NK細胞也是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁。

NK細胞療法的優勢：（1）NK細胞活性高，可殺傷任何癌細胞，目前為止幾乎沒有發現高活性NK細胞殺不死的癌細胞；（2）有效刺激免疫力，激活免疫系統，沒有毒副作用；（3）有效去除手術、放療后殘留的癌細胞；（4）NK細胞能夠增強患者的免疫功能，同時具有抗惡性腫瘤和抗病毒的作用；（5）NK細胞是先天性細胞，可破壞任何癌細胞，是免疫細胞治療的主力隊員。

雖然NK細胞的抗癌效果的安全性和療效得到肯定，但由于它僅占外周血淋巴細胞的10％-30％，因而如何獲得高純度、高質量地NK細胞產品是NK治療的關鍵。近幾年發現通過體外的刺激培養可進行相對大規模的NK細胞制備，己知IL-2、 IL-15、IL-18和IL-7等細胞因子在對NK細胞的體外擴增上發揮重要作用，它們體外擴增NK 細胞的倍數在幾倍至數十倍不等。IL-2是重要的誘導NK細胞增殖的細胞因子，它可以激活 NK細胞、促進NK細胞增殖和細胞因子的產生。IL-15和IL-7的作用與IL-2相似，同時它們還可通過與NK細胞表面表達的復合受體γ鏈結合，促進造血干細胞定向分化為NK細胞，且對 NK細胞的發育、分化和維持長期體外存活等方面發揮重要作用。IL-15與IL-2的協同作用也使兩者聯合作用于NK細胞的體外擴增，是目前NK細胞體外擴增最傳統的細胞因子組合。據報道IL-18不但能誘導活化的THi細胞分泌產生大量的IFN-γ，更能通過促進Fas-FasL通路的開放，增強NK細胞的細胞毒性，且呈劑量依賴性。

目前市場上已有NK細胞治療產品，但使用的培養體系繁雜、擴增倍數及殺瘤效果不佳、凍存后復蘇效果差、部分培養體系存在安全風險等問題。由此，自然殺傷細胞的培養、誘導、激活、凍存方法有待改進。

發明內容