[發明專利]尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010370261.8
• 申請日: 2020-05-06
• 公開（公告）號: CN111607657A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 孫宗科;朱建寧;張鐳;沈頌東;車團結;石勇;高愷;李瀟玲;鄭曉玲
• 申請（專利權）人: 蘭州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 劉小彬

本發明公開了尖孢鐮刀菌的RT?QPCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法，屬于生物技術領域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；試劑盒包括上述引物及探針。熒光定量PCR檢測方法包括：提取待測樣品總DNA；制備反應體系；將模板梯度稀釋制成標準曲線樣品及陽性對照樣品；將待測樣品、標準曲線樣品、陽性對照樣品、陰性對照樣品使用引物和探針進行熒光定量PCR擴增；繪制標準曲線，計算結果。本發明的引物、探針及試劑盒，具有高度特異性和良好的靈敏度，能快速、準確度地尖孢鐮刀菌進行檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及尖孢鐮刀菌的實時熒光定量PCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術

尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)可侵染多種植物引起維管束萎蔫病害，對農業生產造成嚴重威脅。是植物根腐病的主要致病菌，能對三七、天麻、太子參、棉花等產生危害。尖孢鐮刀菌能侵入植物根部引起根腐或侵入植物維管束系統導致植物萎蔫枯死，并在植物全生長過程中均可發生，其他菌株雖能侵入根部但不能侵入植物維管束系統引起病害。該病會造成根部腐爛，導致植物吸收水分和養分的功能逐漸減弱，最后全株死亡，主要表現為整株葉片發黃、枯萎。尖孢鐮刀菌具有易變異以及多型性的特點，種內生力分化十分明顯，在種下又可分為多個專化性和生理小種，因此鐮刀菌的遺傳多樣性一直是研究的熱點。多年來，人們都是依據形態學特征、致病性及營養體融合群等試驗來研究該菌的的多態性，而這些方法既費時又費力又不能準確地揭示物種的進化關系。

現有技術中，采用多重PCR檢測尖孢鐮刀菌雖然特異性好、準確性高，然而其PCR結果需要通過瓊脂糖電泳進行分析，影響因素較多。隨著分子生物學技術的不斷發展，RT-QPCR(實時熒光定量PCR)目前已廣泛應用于菌種的檢測。其與常規的分離培養方法相比，具有耗時短、操作簡便、特異性好的特點，且結果可直接觀察，能有效避免操作過程中引起的污染。但尖孢鐮刀菌與其它鐮刀屬菌種有著較高的同源性，如腐皮鐮刀菌、三線鐮刀菌、禾谷鐮刀菌。因此提供一種用于尖孢鐮刀菌的PCR檢測方法，具有高度特異性，準確度高，成為了本領域技術人員亟待解決的問題。

發明內容

本發明的目的之一在于，提供一種尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物，特異性好，準確度高。

本發明的目的之二在于，提供一種尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測的探針。

本發明的目的之三在于，提供一種尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測的試劑盒。

本發明的目的之四在于，提供一種尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明通過對NCBI數據庫中尖孢鐮刀菌18SrRNA基因全序列進行生物信息學比對分析，選取適合設計引物和探針的保守片段序列為靶目標，并進一步應用Primer express3軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設計了多組實時熒光定量PCR引物與探針，經過試驗初步篩選，最終確定了一組用于檢測尖孢鐮刀菌的熒光定量PCR引物和探針。

本發明所述的尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；

下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'。

本發明所述的尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測的探針，該探針的核苷酸序列如 SEQ IDNO:3所示：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；優選地，所述探針5’端標記的熒光報告基團為VIC，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ。