[發(fā)明專利]尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010370261.8
• 申請(qǐng)日: 2020-05-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111607657A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫宗科;朱建寧;張鐳;沈頌東;車(chē)團(tuán)結(jié);石勇;高愷;李瀟玲;鄭曉玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘭州百源基因技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51214
• 代理人: 劉小彬

1.尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；

下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'。

2.尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的探針，其特征在于，所述探針的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；優(yōu)選地，所述探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ。

3.尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的引物及探針組合，其特征在于，包括：

上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；

下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'；

探針：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'。

4.一種尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的引物、及權(quán)利要求2所述的探針。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQID NO:4所示；優(yōu)選地，所述模板是以質(zhì)粒的形式存在。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，還包括陰性樣品；優(yōu)選地，所述陰性對(duì)照樣品為ddH₂O。

7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，還包括預(yù)混液；優(yōu)選地，所述預(yù)混液為2×Probe Mix。

8.一種尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系包括：

上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；

下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'；

探針：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；

模板：如SEQ ID NO:4所示；

優(yōu)選地，還包括陰性對(duì)照樣品，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述陰性對(duì)照樣品為ddH₂O。

9.一種檢測(cè)植物尖孢鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1.提取待測(cè)樣品總DNA；

步驟2.制備反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系如權(quán)利要求8所述；

步驟3.將模板梯度稀釋制成標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品及陽(yáng)性對(duì)照樣品；

步驟4.將待測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品使用所述引物和探針，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；

步驟5.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值計(jì)算結(jié)果；

優(yōu)選地，所述步驟3中，梯度稀釋制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的濃度分別為3.1×10⁹copies/μL、3.1×10⁸copies/μL、3.1×10⁷copies/μL、3.1×10⁶copies/μL、3.1×10⁵copies/μL、3.1×10⁴copies/μL、3.1×10³copies/μL、3.1×10²copies/μL、3.1×10¹copies/μL；

優(yōu)選地，所述陽(yáng)性對(duì)照樣品的濃度為3.1×10¹⁰copies/μL。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，RT-QPCR的反應(yīng)條件為：37℃污染消化2min，95℃預(yù)變性10min，95℃15s、60℃40s、72℃20s并收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。