[發(fā)明專(zhuān)利]腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010370248.2
• 申請(qǐng)日: 2020-05-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111549165A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈頌東;車(chē)團(tuán)結(jié);石勇;孫宗科;朱建寧;張鐳;高愷;李瀟玲;鄭曉玲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蘭州百源基因技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51214
• 代理人: 劉小彬

本發(fā)明公開(kāi)了腐皮鐮刀菌的RT?QPCR檢測(cè)的引物、探針、試劑盒及方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；試劑盒包括上述引物及探針。熒光定量PCR檢測(cè)方法包括：提取待測(cè)樣品總DNA；制備反應(yīng)體系；將模板梯度稀釋制成標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品及陽(yáng)性對(duì)照樣品；將待測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品使用引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果。本發(fā)明的引物、探針及試劑盒，具有高度特異性和良好的靈敏度，能快速、準(zhǔn)確度地腐皮鐮刀菌進(jìn)行檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及腐皮鐮刀菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)是植物根腐病的主要致病菌，主要對(duì)黃芪、丹參、甘草、板藍(lán)根等產(chǎn)生危害。根腐病是一種真菌引起的植物病，該病會(huì)造成根部腐爛，導(dǎo)致植物吸收水分和養(yǎng)分的功能逐漸減弱，最后全株死亡，主要表現(xiàn)為整株葉片發(fā)黃、枯萎。腐皮鐮刀菌根據(jù)其形狀、厚垣孢子和長(zhǎng)管瓶的存在確定其為大分生孢子，然而形態(tài)學(xué)鑒定不能區(qū)分不同的生物物種和具有共同形態(tài)特征而基因多樣的有絲分裂菌株，如若采用傳統(tǒng)的鑒定方法，容易出現(xiàn)偏差，且耗時(shí)較長(zhǎng)。

現(xiàn)有技術(shù)中，多重PCR檢測(cè)腐皮鐮刀菌雖然特異性好、準(zhǔn)確性高，然而其 PCR結(jié)果需要通過(guò)瓊脂糖電泳進(jìn)行分析，影響因素較多。。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，RT-QPCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)已廣泛應(yīng)用于菌種的檢測(cè)。其與常規(guī)的分離培養(yǎng)方法相比，具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、特異性好的特點(diǎn)，且結(jié)果可直接觀察，能有效避免操作過(guò)程中引起的污染。但腐皮鐮刀菌與其它鐮刀屬菌種有著較高的同源性，如燕麥鐮刀菌、三線鐮刀菌、禾谷鐮刀菌。因此提供一種用于腐皮鐮刀菌的PCR檢測(cè)方法，具有高度特異性，準(zhǔn)確度高，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于，提供一種腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的引物，特異性好，準(zhǔn)確度高。

本發(fā)明的目的之二在于，提供一種腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的探針。

本發(fā)明的目的之三在于，提供一種腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的試劑盒。

本發(fā)明的目的之四在于，提供一種腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中腐皮鐮刀菌ITS基因全序列進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析，選取適合設(shè)計(jì)引物和探針的保守片段序列為靶目標(biāo)，并進(jìn)一步應(yīng)用 Primer express 3軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設(shè)計(jì)了多組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物與探針，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)初步篩選，最終確定了一組用于檢測(cè)腐皮鐮刀菌的熒光定量PCR引物和探針。

本發(fā)明所述的腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；

下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'。

本發(fā)明所述的腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測(cè)的探針，該探針的核苷酸序列如 SEQ IDNO:3所示：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'；優(yōu)選地，所述探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ。

ITS基因廣泛存在于腐皮鐮刀菌中，具有很高的保守性。本發(fā)明采用腐皮鐮刀菌ITS基因作為靶序列，合成了引物及探針。

本發(fā)明所述的腐皮鐮刀菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物及探針組合，包括：