[發明專利]腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010370248.2
• 申請日: 2020-05-06
• 公開（公告）號: CN111549165A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 沈頌東;車團結;石勇;孫宗科;朱建寧;張鐳;高愷;李瀟玲;鄭曉玲
• 申請（專利權）人: 蘭州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 劉小彬

1.腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；

下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'。

2.腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測的探針，其特征在于，所述探針的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'；優選地，所述探針5’端標記的熒光報告基團為FAM，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ。

3.腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測的引物及探針組合，其特征在于，包括：

上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；

下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；

探針：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'。

4.一種腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測的試劑盒，其特征在于，包括如權利要求1所述的引物、及權利要求2所述的探針。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQID NO:4所示；優選地，所述模板是以質粒的形式存在。

6.根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，還包括陰性樣品；優選地，所述陰性對照樣品為ddH₂O。

7.根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，還包括預混液；優選地，所述預混液為2×Probe Mix。

8.一種腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測的反應體系，其特征在于，所述反應體系包括：

上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；

下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；

探針：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'；

模板：如SEQ ID NO:4所示；

優選地，還包括陰性對照樣品，進一步優選地，所述陰性對照樣品為ddH₂O。

9.一種檢測植物腐皮鐮刀菌的RT-QPCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1.提取待測樣品總DNA；

步驟2.制備反應體系，所述反應體系如權利要求8所述；

步驟3.將模板梯度稀釋制成標準曲線樣品及陽性對照樣品；

步驟4.將待測樣品、標準曲線樣品、陽性對照樣品、陰性對照樣品使用所述引物和探針，進行熒光定量PCR擴增；

步驟5.繪制標準曲線，通過標準曲線和待測樣品的Ct值計算結果；

優選地，所述步驟3中，梯度稀釋制得的標準曲線樣品的濃度分別為3.1×10⁹copies/μL、3.1×10⁸copies/μL、3.1×10⁷copies/μL、3.1×10⁶copies/μL、3.1×10⁵copies/μL、3.1×10⁴copies/μL、3.1×10³copies/μL、3.1×10²copies/μL、3.1×10¹copies/μL；

優選地，所述陽性對照樣品的濃度為3.1×10¹⁰copies/μL。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，PCR的反應條件為：37℃污染消化2min，95℃預變性10min，95℃15s、60℃1min并收集熒光信號，40個循環。