[發明專利]冢村氏菌的RT-LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010370211.X
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN111549149A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 曹彥;王心靜;王麗芹
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第八醫學中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 牛艷玲

本發明提供了一種逆轉錄環介導基因恒溫擴增技術(RT?LAMP)檢測冢村氏菌活菌的引物組合、試劑盒及檢測方法，能夠安全、快速、準確檢測冢村氏菌活菌，特異性強、靈敏度高，操作簡便，且可通過肉眼觀察擴增結果，成本低廉，易于在基層推廣使用。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及采用逆轉錄環介導等溫擴增技術檢 測冢村氏菌。

背景技術

冢村氏菌屬(Tsukamurella)在細菌分類學上屬放線菌目，是生長緩慢且具 有弱或不定抗酸性的專性需氧革蘭氏陽性不規則桿菌，迄今為止已發現13種， 其中7種與人類疾病相關。冢村氏菌屬主要侵襲免疫力低下人群，該屬微生物感 染與慢性肺部疾病、免疫抑制(白血病，腫瘤，HIV/AIDS感染)以及術后傷口 感染有關。

冢村氏菌屬與含分枝菌酸的其他物種如放線菌目中的紅球菌屬、諾卡菌屬、 戈登菌屬和分枝桿菌屬等有許多共同的表型特征，因此在標準的生化試驗中可 能被誤判。冢村氏菌屬感染患者多見慢性呼吸系統癥狀，與肺結核相同，其臨 床表現容易與結核分枝桿菌感染引起的肺結核病混淆，不易鑒別。臨床上經常 將冢村氏菌感染誤診為結核桿菌感染，這不僅會影響患者的診斷與治療，也會 導致疫情資料的錯誤。因此，在臨床診斷中，快速鑒定冢村氏菌屬感染對于病 人的治療、醫院的傳染病防治都至關重要。

目前國際上對于冢村氏菌的診斷主要基于生化檢測、限制性酶切片段分析 及16rRNA測序。其中，傳統的生化檢測對于冢村氏菌的檢測需要排除在生化性 狀上極其相似的其它屬，并且要經過數目眾多的一組反應才能確診，而且在某 些情況下結果并不準確，容易誤判。由于該菌生長緩慢(約1周)，且生化反應 所用時間長，種類多，使得對該致病菌的檢測效率低下，完全確診需要2-3周時 間，應用受到限制。而以分子生物學PCR為基礎的限制性酶切片段分析及新近發 展起來的測序技術均需要復雜的儀器設備和技術要求，價格高昂，不利于推廣 普及。

環介導基因恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification ofnucleic acid，LAMP)是一種新型恒溫基因擴增技術，可直接通過肉眼觀察結果，具有快速、簡便、敏感性和特異性高、檢測范圍廣等優點，而且擴增只需單一的恒定 溫度，不需要專門的擴增和檢測儀器即可實現現場高通量快速檢測，具有比常 規PCR技術更廣泛的應用前景。但PCR、LAMP等分子生物學檢測法是針對冢村 氏菌DNA基因為靶序列設計引物并進行擴增，死菌或活菌都呈現陽性效果，無 法用于臨床評估抗菌治療效果。

發明內容

本發明提供了一種逆轉錄環介導基因恒溫擴增技術(reverse transcription-LAMP，RT-LAMP)檢測冢村氏菌活菌的引物組合、試劑盒及檢測 方法，能夠安全、快速、準確檢測冢村氏菌活菌，特異性強、靈敏度高，操作 簡便，且可通過肉眼觀察擴增結果，成本低廉，易于在基層推廣使用。

根據本發明的一個方面，本發明提供一種引物組合，包括：

正向外引物F3：5’-AGGTGTGGGTTTCCTTCCA-3’

反向外引物B3：5’-ATGTCCACCACGTACCGA-3’

正向內引物FIP：

5’-AGTTTCCTTAACTGCCCCCGG-AACGCATTAAGTACCCCGC-3’

反向內引物BIP：

5’-TCGATGCAACGCGAAGAACCTT-CTACACCAAACGGAACACG-3’

正向環引物LF：5’-CCCAGGCGGGGTACTTAATG-3’

反向環引物LB：5’-TACCTGGGTTTGACATATAGAGGA-3’。