[發明專利]冢村氏菌的RT-LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010370211.X
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN111549149A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 曹彥;王心靜;王麗芹
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第八醫學中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 牛艷玲

1.一種引物組合，其特征在于，包括：

正向外引物F3：5’-AGGTGTGGGTTTCCTTCCA-3’

反向外引物B3：5’-ATGTCCACCACGTACCGA-3’

正向內引物FIP：

5’-AGTTTCCTTAACTGCCCCCGG-AACGCATTAAGTACCCCGC-3’

反向內引物BIP：

5’-TCGATGCAACGCGAAGAACCTT-CTACACCAAACGGAACACG-3’

正向環引物LF：5’-CCCAGGCGGGGTACTTAATG-3’

反向環引物LB：5’-TACCTGGGTTTGACATATAGAGGA-3’。

優選地，所述引物組合是冢村氏菌活菌的RT-LAMP檢測用引物。

2.一種試劑盒，其特征在于，含有如權利要求1所述的引物組合。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述外引物和內引物的總摩爾比為1∶2-1∶12，進一步優選為1∶8；所述外引物和環引物的總摩爾比為1∶3-1∶6，進一步優選為1∶4。

優選地，所述正向外引物和反向外引物的摩爾比、所述正向內引物和反向內引物的摩爾比、所述正向環引物和反向環引物的摩爾比均是1∶1。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，進一步含有甜菜堿、MgSO₄、dNTPs、BstDNA聚合酶、重組核糖核酸酶抑制劑和M-MLV反轉錄酶。

優選地，進一步含有鈣黃綠素和MnCl₂。

5.如權利要求2-4中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括擴增反應液，所述反應液含有如下組分：如權利要求1所述的正向外引物、反向外引物、正向內引物、反向內引物、正向環引物、反向環引物、甜菜堿、MgSO₄、dNTPs、BstDNA聚合酶、重組核糖核酸酶抑制劑、M-MLV反轉錄酶。

優選地，所述反應液中進一步含有鈣黃綠素和MnCl₂。

進一步優選，所述反應液中進一步含有buffer、KCl、(NH₄)₂SO₄、Tween20。

進一步優選，所述buffer為Tris-HCl buffer。

6.如權利要求2-5中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中進一步包括陽性對照，所述陽性對照為冢村氏菌RNA，優選微變冢村氏菌標準株RNA。

進一步優選，所述試劑盒中進一步包括陰性對照，所述陰性對照為水，優選DEPC水。

7.如權利要求2-6中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括擴增反應液，所述反應液含有如下組分：5pM如權利要求1所述的正向外引物F3、5pM如權利要求1所述的反向外引物B3各1μL；40pM如權利要求1所述的正向內引物FIP、40pM如權利要求1所述的反向內引物BIP各1μL；20pM如權利要求1所述的正向環引物LF、20pM如權利要求1所述的反向環引物LB各1μL；含pH為8.8的40mM Tris-HCl 2×buffer、20mM KCl、20mM(NH₄)₂SO₄、0.2％Tween20、1.6mM甜菜堿、16mM MgSO₄、2.8mM dNTPs的混合液12.5μL；8U BstDNA聚合酶1μL；20U重組核糖核酸酶抑制劑1μL；100U M-MLV反轉錄酶1μL；5mM/μL鈣黃綠素和10mM/μLMnCl₂的混合液1μL。

8.一種冢村氏菌活菌的RT-LAMP檢測方法：包括如下步驟：

(1)提取待測樣品中的RNA；

(2)使用上述引物或者上述試劑盒擴增步驟(1)得到的RNA；優選地，反應溫度為60-65℃，更優選約63℃；優選地，反應時間為15-50min，更優選約30min；

(3)終止反應，判斷待測樣品中是否含有冢村氏菌活菌；優選地，至少約80℃滅活至少約5min終止反應。

優選地，使用如權利要求7所述的試劑盒中的擴增反應液擴增步驟(1)得到的RNA：將1μl步驟(1)得到的RNA加入到如權利要求7所述的擴增反應液中，并加DEPC水至25μL進行擴增。