[發明專利]快速檢測SPLCV的引物、試劑盒、檢測方法和應用

有效

• 申請號: 202010367637.X
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN111534638B
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發明（設計）人: 劉起麗;李成偉;周鋒;胡海燕;李東宵;宋普文;孫海麗;卜瑞方;于永昂;魏琦超;關園園;胡平;陳二永
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了快速檢測SPLCV的引物、試劑盒、檢測方法和應用，涉及病毒檢測技術領域。所述檢測方法包括提取植物樣品總DNA、設計特異性引物、對待測樣品進行PCR擴增和電泳鑒定。本發明能快速準確檢測到SPLCV病毒，檢測的穩定性好，特異性強，一致性高，適用于大規模推廣，實現了SPLCV病毒高效快速檢測，有利于摸清田間甘薯卷葉病發生狀況，同時利于加快莖尖脫毒甘薯苗的評價，推進引進品種和推廣甘薯苗的無毒化進程，確保甘薯安全生產。

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，更具體的說是涉及快速檢測SPLCV的引物、試劑盒、檢測方法和應用。

背景技術

甘薯卷葉病毒(Sweet potato leafcurl virus,SPLCV)，屬雙生病毒科(Germiniviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，主要寄主是甘薯、裂葉牽牛和圓葉牽牛，其引發的病害可導致甘薯發育異常、產量和質量嚴重受損及種性退化。20世紀80年代，該病害在中國臺灣和日本的甘薯上發生。近幾年，隨著傳播介體煙粉虱的種群及分布不斷增加、甘薯種苗的貿易活動越發頻繁，SPLCV的迅速擴散和廣泛發生已經引起全球的關注。

目前，檢測SPLCV的方法主要有ELISA、高通量測序法和PCR方法，但ELISA方法耗時長，工作量大，靈敏度低，檢測步驟繁瑣，高通量測序法花費較高，不利于大量樣本的檢測，PCR方法缺乏適合中國SPLCV病毒種群序列特征的通用引物而經常導致假陰性的結果，且到目前為止，國內尚無PCR快速檢測甘薯上SPLCV的方法報道。

因此，提供一種快速檢測甘薯SPLCV的引物、試劑盒、檢測方法和應用是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了快速檢測SPLCV的引物、試劑盒、檢測方法和應用。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種快速檢測SPLCV的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

上游引物P2F:5’-CCT GGA TTG CAG AGG AAG A-3’，SEQ ID NO.1；

下游引物P2R:5’-AGC AAT TGG GAC AGC ATT C-3’，SEQ ID NO.2。

進一步的：一種快速檢測SPLCV的試劑盒，含有檢測溶液，所述檢測溶液至少包括所述的引物。

優選的，所述試劑盒還包括dNTPs、Ex-Taq反應緩沖液和Ex-Taq酶。

進一步的：一種SPLCV的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

進一步的：一種快速檢測SPLCV的方法，包括以下步驟：

(1)提取植物樣品總DNA；

(2)以提取的植物樣品總DNA為模版，用所述的引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；

(3)凝膠電泳鑒定所述PCR產物，得到1500bp條帶時判斷植物樣品中存在SPLCV。

優選的，步驟(1)中所述植物樣品包括甘薯春、秋梢嫩葉、葉脈及附近組織或甘薯薯塊內部組織。

所述植物樣品進一步優選為甘薯春、秋梢嫩葉、葉脈及附近組織，優勢在于上述組織部分在于嫩葉上易積累病毒。

優選的，所述PCR擴增的反應體系如下：

2.5mM dNTPs 4μL、10×Ex-Taq反應緩沖液5μL、10μM上游引物1μL、10μM下游引物1μL、Ex-Taq酶1μL、DNA 1μL，ddH₂O補足50μL。