[發明專利]一種雙功能酶生物催化劑及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010364953.1
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN112143718B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 李偉;李珊珊;陳倩;石山;李陽;王鑫
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 重慶啟恒騰元專利代理事務所(普通合伙) 50232
• 代理人: 黎志紅

本發明提供一種雙功能酶生物催化劑，其具有羰基還原氨化和輔酶(NADH)再生兩個功能，能同時催化羰基還原氨化和輔酶(NADH)再生兩個生物轉化過程，生物轉化時間短，轉化催化效率高，同時減少參與(S)?環丙基甘氨酸生物催化合成過程中所需酶數量。本發明雙功能酶生物催化劑通過基因重組技術，質粒表達制得。將本發明的雙功能酶生物催化劑，用(S)?環丙基甘氨酸的生物催化不對稱合成，無需按照化學反應計量添加昂貴的輔酶NADH。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種雙功能酶生物催化劑及其制備方法和應用。

背景技術

非天然氨基酸是一類非常重要的有機化合物，是合成多種手性藥物、手性農藥和手性食品添加劑等精細化工品的重要原料和關鍵中間體。特別是，(S)-環丙基甘氨酸(分子式：C₅H₉NO₂，分子量為：115.13，CAS：49606-99-7)是一種含環丙基的非天然氨基酸，被廣泛用于多肽類似物和藥物設計與合成(參見文獻Chem.Rev.,2007,107,4538-4583；Russ.Chem.Bull.,2013,62,928-952；J.Med.Chem.,2016,59,8712-8756)。(S)-環丙基甘氨酸主要有化學合成和酶拆分兩種制備途徑?；瘜W合成(S)-環丙基甘氨酸，如利用Strecker反應引入手性中心(J.Med.Chem.,2009,52,7653-7668；Org.Process?Res.Dev.,2010,14,1221-1228)或利用Strecker型手性輔助試劑合成(J.Org.Chem.,1983,48(26),5369-5373)，合成過程須使用昂貴的原料和劇毒KCN以及大量的有機溶劑，同時制備工藝路線較長，反應時間長，收率較低。酶拆分制備(S)-環丙基甘氨酸，如利用Acylase?I酶(J.Am.Chem.Soc.,1989,111,6354-6364)或Papain酶(Adv.Synth.Catal.,2006,348,1071-1078)拆分消旋體進行分離合成，酶拆分的缺陷在于最大理論產率只有50％，故這些方法難以實現工業化。

生物催化合成非天然氨基酸具有立體選擇性高、催化活性高、環境友好、反應條件溫和等獨特優勢。Hanson等(Org.Process?Res.Dev.,2012,16,464-469)選用亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶借助還原型輔酶(NADH)，利用酶偶聯方法(如圖1所示)將環丙基羰基乙酸還原氨化制備(S)-環丙基甘氨酸。酶偶聯方法須分別表達亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶，而羰基還原氨化和輔酶再生在兩個獨立菌體中完成，輔酶必須在兩個不同菌體之間轉運擴散，但受菌體自身結構限制和自由擴散影響，輔酶在兩個菌體間的傳質阻力導致生物轉化時間長，催化效率低。同時需要兩種酶才能完成生物轉化過程，導致成本增加，不利于工業化。

發明內容

為了解決現有技術中的問題，根據本發明的第一方面，本發明的目的在于提供一種雙功能酶生物催化劑。

本發明的目的是這樣實現的：

一種雙功能酶生物催化劑，其特征在于：所述雙功能酶生物催化劑的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發明雙功能酶生物催化劑具有羰基還原氨化和輔酶(NADH)再生兩個功能，能同時催化羰基還原氨化和輔酶(NADH)再生兩個生物轉化過程，生物轉化時間短，轉化催化效率高，同時減少參與(S)-環丙基甘氨酸生物催化合成過程中所需酶數量。

本發明雙功能酶生物催化劑為同時具有羰基還原氨化和輔酶再生能力的高效表達雙功能酶的重組大腸桿菌全細胞。

本發明雙功能酶在大腸桿菌中高表達，并直接以此全細胞作為生物催化劑，在單個重組大腸桿菌全細胞內同時完成羰基還原氨化和輔酶(NADH)再生兩個過程(如圖2所示)，本發明雙功能酶生物催化劑具有輔酶(NADH)再生能力，為羰基還原氨化過程提供所需輔酶，實現輔酶循環利用以降低生產成本。本發明減少參與(S)-環丙基甘氨酸生物催化合成過程中所需酶數量，可降低酶的使用成本。