[發(fā)明專利]一種雙功能酶生物催化劑及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010364953.1
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN112143718B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李偉;李珊珊;陳倩;石山;李陽;王鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 重慶啟恒騰元專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50232
• 代理人: 黎志紅

1.一種雙功能酶生物催化劑，其特征在于：所述雙功能酶生物催化劑為同時具有羰基還原氨化和輔酶再生能力的高效表達雙功能酶的重組大腸桿菌全細(xì)胞，所述雙功能酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.如權(quán)利要求1所述雙功能酶生物催化劑的制備方法，其特征在于，采用如下步驟：

步驟(1)

用基因重組技術(shù)，將編碼權(quán)利要求1中所述雙功能酶的全長基因tlf連接到載體pET28a上，形成質(zhì)粒pET28a-tlf；

步驟(2)

將步驟(1)形成的質(zhì)粒pET28a-tlf轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli?BL21(DE3)，接種卡拉霉素抗性的Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基，放大培養(yǎng)，誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達雙功能酶，4℃離心收集菌體，用緩沖溶液洗滌，既得。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達雙功能酶的培養(yǎng)時間為24-72小時。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達雙功能酶的培養(yǎng)溫度為16-30℃。

5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述的卡拉霉素的濃度為50-200μg/L；所述誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達雙功能酶的誘導(dǎo)劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，濃度為0.4-1.0mM。

6.權(quán)利要求1所述雙功能酶生物催化劑在合成(S)-環(huán)丙基甘氨酸中的應(yīng)用。

7.一種(S)-環(huán)丙基甘氨酸的合成方法，其特征在于：將權(quán)利要求1所述雙功能酶生物催化劑分散在pH值為7.2-7.4的緩沖溶液中，加入環(huán)丙基羰基乙酸鉀，甲酸銨和輔酶NADH，在20-60℃條件下，pH為6.0-9.0，以50～150rpm轉(zhuǎn)速振蕩，生物轉(zhuǎn)化時間為1-18h。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：輔酶的濃度為0.1-0.3mM。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

將雙功能酶生物催化劑分散在緩沖溶液中，加入環(huán)丙基羰基乙酸鉀，甲酸銨和輔酶NADH，輔酶的濃度為0.1-0.3mM，在20-60℃條件下，pH為6.0-9.0，以50～150rpm轉(zhuǎn)速振蕩，生物轉(zhuǎn)化時間為1-18h；所述緩沖溶液為10mM磷酸緩沖鹽溶液PBS，含NaCl?137mM，KCl2.7mM，Na₂HPO₄?10mM，KH₂PO₄?2mM，pH值為7.2-7.4。