[發明專利]高效液相色譜法測定L-纈氨酸原料中其他氨基酸的方法

有效

• 申請號: 202010364918.X
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN111505151B
• 公開（公告）日: 2022-09-02
• 發明（設計）人: 王成;張國龍;李芹元;王孟華;曾憲亮
• 申請（專利權）人: 宜昌三峽普諾丁生物制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/54
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

本發明提供一種用高效液相色譜法測定L?纈氨酸原料中其他氨基酸的方法，配制L?正纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸對照品溶液；經高效液相色譜儀檢測，供試品色譜圖與對照品溶液色譜圖中L?正纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的出峰時間及峰形進行對比，判定供試品溶液中是否含有其他氨基酸。本方法通過篩選氨丙基鍵合硅膠色譜柱，找到分離效果，篩選波長，找到各氨基酸的最大吸收，并利用乙腈/磷酸鹽緩沖液二元流動相，通過調節三乙胺比例、pH值及兩相比例來調控各氨基酸峰在色譜柱上的保留時間，有效防止氨基柱中鍵合氨丙基的水解脫落，解決氨基柱反相使用壽命不長，基線不穩的問題。

技術領域

本發明涉及一種測定L-纈氨酸原料中其他氨基酸的方法，具體為采用高效液相色譜法檢測L-纈氨酸原料中L-正纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的殘留的方法。

技術背景

L-纈氨酸(L-2-氨基-3-甲基丁酸；CAS號：72-18-4)屬人體必需氨基酸，作為氨基酸類藥，營養增補劑，可作氨基酸輸液、綜合氨基酸制劑的主要成分。其具有分子式C₁₀H₂₀N₂O₄，且具有下述結構式：

L-纈氨酸是三個支鏈氨基酸之一，屬必需氨基酸，可治療肝功能衰竭、中樞神經系統功能紊亂，其作為氨基酸輸液、綜合氨基酸制劑的主要成分，具有廣泛的市場前景。針對發酵法生產纈氨酸均為L-型，無需旋光拆分，但在成品中會存在一些其他氨基酸，給其臨床應用帶來一些影響。同時由于L-纈氨酸其他氨基酸檢測，在中國藥典2015年版和美國藥典42版均采用薄層色譜法，其檢測靈敏度差，各類氨基酸不明確，無法明確顯示各類其他氨基酸的具體含量。采用美國藥典40版的磷酸鹽和乙腈二元流動相體系，氨基柱使用壽命不長，基線不穩，且L-纈氨酸與本發明提到的其他氨基酸無法基線分離。采用氨基酸分析儀，設備成本和檢測成本昂貴，不宜普及。本發明針對現有技術不足，經過長期實踐研究，確定一種靈敏度高，檢測時間短的其他氨基酸檢測方法，其能夠快速靈敏的檢測出L-正纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的含量，并且能夠使L-纈氨酸與其他氨基酸基線分離。

發明內容

本發明的技術方案利用高效液相色譜法測定L-纈氨酸原料中其他氨基酸含量的檢測方法。本方法通過篩選不同品牌的氨丙基鍵合硅膠色譜柱，找到分離效果，基線效果最好的色譜柱，篩選波長，找到各氨基酸的最大吸收，并利用乙腈/磷酸鹽緩沖液二元流動相，通過調節三乙胺比例、pH值及兩相比例，選擇合適三乙胺的量、pH及兩相比例來調控各氨基酸峰在色譜柱上的保留時間，提高峰的分離度和理論塔板數，改善色譜峰形，空白溶劑不干擾各氨基酸的檢測，并有效防止氨基柱中鍵合氨丙基的水解脫落，解決氨基柱反相使用壽命不長，基線不穩的問題。

本發明實施例采用了如下技術方案：

一種用高效液相色譜法測定L-纈氨酸原料中其他氨基酸的方法，在以下色譜條件下進行高效液相色譜分析：

色譜柱：氨丙基鍵合硅膠色譜柱；

流動相：體積比為70～76：24～30的乙腈與磷酸鹽緩沖液的混合溶液，其中磷酸鹽緩沖液濃度為10～20mmol/L，加入0.1％-0.3％的三乙胺，用磷酸調節pH為6.0～6.5；

流速：0.8～1.2ml/min；

柱溫：20～30℃；

進樣體積：20μl；

檢測波長：UV210nm。