[發(fā)明專利]蛋白質樣品濃度測定方式選擇法及測定方法

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• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN113588582A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設計）人: 張佳琳;屈晨;黃瞳瞳;徐穎妍;李秀春;李姝蘋;李志國;喬婧;曹曉林
• 申請（專利權）人: 上海藥明生物技術有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N21/31
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

本公開涉及一種蛋白質樣品濃度測定方式選擇法及測定方法，具體公開了一種選擇蛋白質樣品測定方式及參數的方法，以及采用所選測定方式及參數測定所述蛋白質樣品中蛋白質濃度的方法。本公開的方法改善了蛋白質樣品濃度測定過程繁瑣、耗時費力的現(xiàn)狀，同時對儀器參數設置進行優(yōu)化，解決了高濃度、高消光系數蛋白質樣品測定結果與理論值有較大偏差的問題。

技術領域

本公開涉及生物分析領域，具體涉及一種快速準確的測定蛋白質樣品濃度的方法，尤其是測定高濃度、高消光系數蛋白質樣品濃度的方法。

背景技術

在生物分析領域，蛋白質樣品的濃度測定多采用傳統(tǒng)的紫外分光光度法(UV)，其測定原理基于朗伯-比爾定律(Lambert-Beer Law)：A＝Ecl，式中A為吸光度，E為摩爾消光系數(與吸收物質的性質和入射光的波長λ有關)，c為吸光物質濃度(單位：mol/L)，l為透光液層厚度(單位：cm)。一般來說，當吸光度在0.3～0.7之間時，儀器具有較小的測定誤差和較高的靈敏度。

然而，朗伯-比爾定律必須滿足以下適用條件：a.入射光為單色平行光；b.吸收發(fā)生在均勻介質中；c.吸收物質及溶劑無相互作用。因此，在實際應用當中，偏離朗伯-比爾定律的情況很多，往往吸光物質濃度越高，測量誤差越大，且絕大多數是向下偏離。

目前，對于濃度較高的蛋白質樣品，多采用稱重稀釋法來獲得較低濃度的樣品，且需測定稀釋前后樣品溶液的密度來計算稀釋倍數。這些過程繁瑣，且易引入稱量和稀釋操作過程中的人為誤差。這對于需要對蛋白質樣品濃度進行精確計量的領域或過程，例如生物制藥產品研發(fā)過程和質量控制體系，都造成了潛在風險。

可變光程分光光度法是光程可發(fā)生變化的分光光度測定方法。例如，其光程長度可為0.005mm～15mm。該領域中世界首臺可變光程的UV-Vis分光光度計是SoloVPE系統(tǒng)，由CTechnologies,Inc提供。該儀器可為斜率光譜系統(tǒng)，其將光纖技術與傳統(tǒng)的光譜技術相結合。光纖耦合器捕獲來自Agilent Cary 60紫外分光光度計的光束，并將其帶入光纖(Fibrette^TM)，光纖插入樣品溶液使光束進入樣品并到達樣品池下方的檢測器。光纖可相對樣品池底部上下移動以精確控制光程的變化。該系統(tǒng)可通過變換不同的光程測得對應的吸光度，以吸光度對光程作圖并進行線性回歸分析，可得線性方程：A＝ml+b，其中A為吸光度，m為斜率，l為光程，b為截距。根據朗伯-比爾定律，A＝Ecl，經變換后即為：A/l＝Ec＝m，在已知消光系數E的條件下，即可根據公式c＝m/E求出濃度c。

以SoloVPE為例，與傳統(tǒng)的UV法相比，可變光程技術有著如下顯著區(qū)別：

(1)SoloVPE的光程變化范圍為0.005～15.000mm，而傳統(tǒng)UV法為10mm；

(2)SoloVPE可設置多個光程，而傳統(tǒng)UV的光程固定；

(3)SoloVPE測定無需稀釋即可直接測定，傳統(tǒng)UV法需通過稱重稀釋法將其稀釋至合適的范圍；

(4)SoloVPE一般情況下無需背景校正，而傳統(tǒng)UV法需要。

由于SoloVPE不涉及天平稱量、密度測定等繁瑣操作，其尤其對于GMP實驗室大大節(jié)省了人力和時間，具有高效率和高通量的顯著優(yōu)勢，深受分析人員的青睞。

目前絕大部分關于SoloVPE的文獻均突出SoloVPE測定快速、準確度高、精密度好等優(yōu)點，認為其可以完全替代傳統(tǒng)UV。然而，申請人在實際應用和研究中發(fā)現(xiàn)，事實上SoloVPE在實際應用中存在一定的限制。