[發明專利]一種低質量DNA二代測序文庫構建方法

在審

• 申請號: 202010364441.5
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN111440848A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 楊靜;楊俊波;林春艷;曾春霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 昆明同聚專利代理有限公司 53214
• 代理人: 蘇蕓蕓

本發明公開了一種低質量DNA二代測序文庫構建方法，該方法先提取低質量樣本中的DNA，然后利用高度降解樣本中植物性DNA的檢測引物對提取的低質量DNA樣本進行多重PCR擴增，確定DNA中是否有植物性DNA；對含有植物性DNA的低質量DNA樣本進行建庫樣品質量檢測，檢測后根據結果進行樣品分類處理，最后采用處理后樣品進行低質量DNA的二代測序文庫構建，本發明方法操作簡便、在保證文庫質量的同時減少了試劑的用量，降低了實驗成本，大大提高了低質量DNA的二代測序成功率。

技術領域

本發明屬于分子生物學和基因組學實驗技術領域，主要涉及一種利用低質量植物樣品（蠟葉標本、高度降解植物組織）中的DNA進行二代測序建庫的方法。

背景技術

二代測序技術，又稱下一代測序技術（Next-Generation Sequencing），可一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此又稱為大規模并行測序；目前主流的測序平臺主要包括利用焦磷酸測序的Roche/454FLX、邊合成邊測序的Illuminasequencingsystems(HiSeq系列、Genome Analyzer IIx、MiSeq) 和連接酶測序法的lifetechnologies Sequencing systems(Applied Biosystems SOLID及Ion Torren)。二代測序技術的出現使得可對一個物種的基因組和轉錄組進行深入、細致、全貌的分析，所以又被稱為深度測序（Deep Sequencing）。

較之一代測序技術，二代測序的成本大幅度降低，加之其超高的測序能力使得二代測序技術能夠為更多的科研和臨床應用服務；即便如此，所有二代測序平臺都涉及到自成體系的文庫制備過程，而文庫制備對DNA的質量有一定要求，通常要求在瓊脂糖凝膠電泳中要有可見的明顯主帶，無降解（或輕微降解），DNA濃度不小于15ng/μL；同時，建庫的DNA起始量也有較高要求，通常需要1-0.5μg。這些制約條件影響了二代測序技術在更多研究領域內的發展和應用。在實際的植物研究工作中，往往需要對一些難以獲取或者已經無法獲取植物材料的物種開展研究，這就只能從館藏蠟葉標本或者采集時間久遠、存儲方式不當的植物材料入手；又或者鑒定諸如經炮制的中草藥、環境、土壤中的植物樣本，甚至是殘存的樹皮木屑等。這些材料往往因為各種原因造成其提取出來的DNA高度降解、產量極低，不符合二代測序的實驗要求，商業公司無法完成測序，科研用戶自身也無法利用這類植物材料進行研究。

為了能夠利用僅能從上述材料中提取出的這些低濃度、低質量的植物DNA進行科學研究，就需要提高現有二代測序建庫技術，探索出一種適用于低質量DNA的文庫構建方法。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種低質量DNA二代測序文庫構建方法，該方法針對高度降解的低質量植物DNA提供了一種有效的二代建庫方法；該方法操作簡便、在保證文庫質量的同時減少了試劑的用量，降低了實驗成本，大大提高了低質量DNA的二代測序成功率。

本發明低質量DNA的二代測序文庫構建方法如下：

（1）利用高度降解樣本中植物性DNA的檢測引物對提取的低質量DNA樣本進行多重PCR擴增，確定DNA中是否有植物性DNA，以此判定低質量DNA樣本的污染程度和作為是否進行下一步建庫實驗的依據；當擴增的3條目的片段出現一條的，即確認該樣本中含有植物性DNA，并將該提取的低質量DNA樣本用于下一步建庫實驗；

所述高度降解樣本中植物性DNA的檢測引物來源于申請號201810111142.3“高度降解樣本中植物性DNA的檢測引物”中，序列如下：

100堿基引物對，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

70堿基引物對，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

50堿基引物對，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；