[發明專利]一種低質量DNA二代測序文庫構建方法

在審

• 申請號: 202010364441.5
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN111440848A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 楊靜;楊俊波;林春艷;曾春霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 昆明同聚專利代理有限公司 53214
• 代理人: 蘇蕓蕓

1.一種低質量DNA二代測序文庫構建方法，其特征在于，步驟如下：

（1）利用高度降解樣本中植物性DNA的檢測引物對提取的低質量DNA樣本進行多重PCR擴增，確定DNA中是否有植物性DNA，當擴增的3條目的片段出現一條的，即確認該樣本中含有植物性DNA，并將該提取的低質量DNA樣本用于下一步建庫實驗；

（2）對含有植物性DNA的低質量DNA樣本進行建庫樣品質量檢測，采用E-Gel預制瓊脂糖凝膠電泳系統對低質量DNA樣本進行電泳檢測，同時使用Qubit3.0核酸蛋白熒光定量儀結合Qubit? dsDNA HS分析試劑盒，對低質量DNA樣本進行精確定量；

（3）經步驟（2）電泳檢測樣本顯示無主帶，但可見DNA彌散帶，且樣本濃度大于0.04ng/μL的低質量DNA樣本，將樣本稀釋至0.04ng/μL濃度后，取稀釋液進行建庫；經步驟（2）電泳檢測樣本無主帶的，有微弱DNA彌散帶或者無彌散帶，且樣本濃度過低，Qubit3.0核酸蛋白熒光定量儀無法定量的低質量DNA樣本，直接使用原液進行建庫；

（4）取25μL低質量DNA樣本的稀釋液或原液進行末端補平及加A尾反應，反應體系為30μL體系；

反應體系為DNA 樣本25μL、UltraⅡEnd Prep Enzyme Mix 1.5μL、UltraⅡEndReaction Buffer 3.5μL；反應條件為20℃，30min；65℃，30min；4℃，保存；

（5）取步驟（4）反應產物進行接頭連接反應，反應體系為46.7μL體系，使用的接頭為NEBNext Adaptor #E6609；

反應體系為步驟（3）產物30μL、Ultra Ⅱ Ligation Master Mix 15μL、LigationEnhancer 0.5μL、0.6μmol/L NEBNext Adaptor 1.2μL；反應條件為20℃，15min；程序執行中關閉PCR儀熱蓋；反應結束后立即在上述連接產物中加入1.5μL的USER^TM Enzyme，混勻后置于37℃，15min，程序執行中PCR儀熱蓋溫度大于等于50℃；

（6）在步驟（5）反應產物中添加0.9～1×AMPure XP Beads磁珠進行純化，純化完成，用ddH₂O將純化后的DNA洗脫下來；

（7）對步驟（6）純化產物進行PCR擴增富集，反應體系為步驟（6）純化產物20μL、Idex/Universal Primer Mix 5μL、UltraⅡQ5 Master Mix 12.5μL；

反應條件：98℃預變性，30s；98℃變性，10s；65℃退火/延伸，75s；進行16個循環；65℃最后延伸，5min；4℃，保存；使用0.9～1×AMPure XP Beads磁珠對PCR產物進行純化，純化后的上清液即為建好的文庫；

（8）PCR純化產物采用Agilent 2100 BioAnalyzer檢測純化產物的長度分布范圍，Qubit3.0核酸蛋白熒光定量儀結合Qubit? dsDNA HS分析試劑盒，對文庫進行精確定量。

2.根據權利要求1所述的低質量DNA二代測序文庫構建方法，其特征在于：E-Gel預制瓊脂糖凝膠電泳系統中瓊脂糖凝膠濃度為2%。

3.根據權利要求1所述的低質量DNA二代測序文庫構建方法，其特征在于：高度降解樣本中植物性DNA的檢測引物如下：

100堿基引物對，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

70堿基引物對，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

50堿基引物對，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。