[發明專利]一種基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒

在審

• 申請號: 202010359815.4
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN111500777A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 金勇豐;張鵬;謝珍;邢寬;何志健
• 申請（專利權）人: 嘉興實踐醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，包括微載體、引物對和探針；所述微載體具有與冠狀病毒一一對應的編碼信息，所述的引物對包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述探針序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根據權利要求1所述的基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，其中，所述探針的核酸在5’端連接有熒光報告基團，在核酸的3’端連接有熒光淬滅基團，且兩個探針的熒光報告基團不同。

3.根據權利要求1所述的基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，其中，所述熒光報告基團選自FAM、VIC、ROX、CY3和CY5中的任一種。

4.根據權利要求1所述的基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，其中，所述熒光淬滅基團選自TAMRA、BHQ1、BHQ2和NFQ中的任一種。

5.根據權利要求1所述的基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，其中，所述試劑盒還包含PCR緩沖液以及Taq酶。

6.根據權利要求1所述的基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。

7.根據權利要求6所述的基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，其中，所述陽性對照液為含有新型冠狀病毒的擴增序列。

8.根據權利要求6所述的基于熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的試劑盒，其中，所述陰性對照為RNase Free H₂O。

9.一種新型冠狀病毒的RT-PCR檢測方法，該方法包括以下步驟：

一、RT-PCR引物和探針設計

根據已獲得的新型冠狀病毒外膜蛋白基因序列，使用軟件Primer Premier 5設計2條用于建立檢測方法的引物和1條探針，所述引物和探針序列如SEQ ID NO：1～3所示：

二、采集樣品，將含有檢測目的片段重組質粒的構建和作為陽性對照的小RNA片段的制備，在體外構建用于體外轉錄的重組質粒，然后體外轉錄獲得小RNA片段；

三、引物的特異性實驗和靈敏度檢測實驗

1)特異性檢測

使用冠狀病毒的RNA為模板進行RT-PCR實驗；RT-PCR和PCR反應條件和程序如下：

混合均勻后42℃反應1h，70℃反應15min終止反應后迅速置于冰上，然后將獲得的逆轉錄產物作為模板進行PCR擴增，反應體系和反應程序如下：

PCR程序為：60℃15min；95℃10s，92℃30s，60℃60s，45個循環；72℃5min；

2)靈敏度檢測實驗

檢測該方法的敏感性，分別取不同濃度梯度的作為陽性對照的RNA 2μl為模板進行RT-PCR，逆轉錄和PCR條件和程序同特異性實驗，然后使用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。