[發明專利]一種高通量的病原體微生物基因檢測篩查方法

在審

• 申請號: 202010359019.0
• 申請日: 2020-04-29
• 公開（公告）號: CN111549109A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 楊功達;曾豐波;胡秀弟
• 申請（專利權）人: 蘇州蘇因智啟生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6874
• 分類號: C12Q1/6874;C12Q1/70;G16B20/30;G16B25/20;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;田歡

本發明屬于生物領域，尤其設計一種高通量的病原體微生物基因檢測篩查方法。一種高通量的病原體微生物基因檢測篩查方法，包括：S1：設計探針；S2：芯片合成；S3：提取樣品中的DNA或RNA；S4：文庫構建；S5：文庫目標區域雜交捕獲和測序；S6：采用高通量測序平臺檢測；S7：進行生信分析，采用Samtools來計算病原體基因組序列每個位點的深度；與探針目標區域重疊的序列被視為“目標序列”；相反，則被視為“非目標序列”。本發明通過一次檢測，可同時實現“靶向病原體檢測”和“宏基因組檢測”，既能提高靶向病原體的檢測靈敏度，又能檢測到未設計探針的病原體，擴大了檢測范圍。

技術領域

本發明屬于生物領域，尤其設計一種高通量的病原體微生物基因檢測篩查方法。

背景技術

病原體微生物的檢測和鑒定對臨床上判斷感染類型及進行有針對性的治療都具有非常重要的意義。病原體微生物種類繁多，來源廣泛，而即使是不同種類的病原體感染，表現在臨床癥狀上具有一定的相似性，比如普遍伴有發燒等癥狀，所以很難從臨床表現區分感染類型，而準確有效的篩查或診斷檢測方法具顯得至關重要。目前臨床上采用的病原體微生物檢測方法主要有培養法，基于蛋白的抗原抗體特異性檢測，以及基于核酸的基因檢測，常見的有QPCR，一代測序和高通量測序等等。由于培養條件的局限性，可被培養的微生物種類較少，而且培養需要較長的時間周期，培養法的劣勢比較明顯。基于抗原抗體特異性檢測具有速度快的優勢，但能夠檢測的微生物種類不多，而且無法準確地確定具體的病原體微生物的物種。核酸檢測具有較強的普遍性，在病原體微生物的檢測上有著越來越廣的應用。

病原體微生物的基因檢測方法中，QPCR是應用最多的一種技術，通過選取微生物基因組中物種特異的序列，設計相應的引物或探針，通過相對定量的方法來確定樣品中是否存在該病原體的感染，并計算病原體的基因組組拷貝數。QPCR對檢測已知的病原體，有較大優勢，成本低，速度快，準確率高。但臨床上，多種病原體可能會有類似的感染癥狀，而QPCR的檢測位點有限，需要多次檢測才能滿足對多種病原體實現檢測的需求。同時，還有一些罕見或未知的病原體，又會引發臨床癥狀，這些感染類型QPCR很難解決。

由于高通量測序成本的下降，以及目標區域捕獲技術的發展，基于高通量測序的病原體感染檢測也被越來越多地用到。目前常見的檢測方式主要分為全基因組或宏基因組(WGS)和目標區域捕獲測序兩類。宏基因組測序不作任何假設前提，對待測樣品中的所有物種的基因組都進行檢測，雖然檢測的范圍很廣，但是要求的數據量很大，并且其中大部分的數據都是來自背景的序列，數據有效率很低，檢測的靈敏度有限，成本又非常高。

目標區域捕獲測序，事先將一系列病原體的物種特異序列設計成探針或引物，對待測樣品中的DNA進行目標區域富集，再進行測序分析。目標區域捕獲測序常用的方法主要有液相雜交捕獲，和多重PCR兩類。目標區域捕獲測序對目標區域進行了富集，檢測的靈敏度相比全基因組測序大大提高，同時需要的測序數據量也較小，成本較低。但它只針對事先確定的病原體微生物進行檢測，檢測范圍存在一定的局限性。

發明內容

本發明的目的是通過液相雜交技術和高通量測序技術，同時實現對已知和未知病原體的篩查。既可以對目標的病原體進行捕獲和富集，提高檢測的靈敏度，又可以通過對“非目標區域”的序列進行分析，擴大檢測范圍。

具體的，本發明的技術方案如下：

本發明第一個方面公開了一種高通量的病原體微生物基因檢測篩查方法，包括：

S1：設計探針；

S2：芯片合成；

S3：提取樣品中的DNA或RNA；

S4：文庫構建；

S5：文庫目標區域雜交捕獲和測序；

S6：采用高通量測序平臺檢測；