[發(fā)明專利]第101位點(diǎn)發(fā)生突變的橡膠樹EPSPS基因及其檢測方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010357066.1
• 申請日: 2020-04-29
• 公開（公告）號: CN111500603B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張宇;王萌;李曉娜;肖厚貞;張冬
• 申請（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12Q1/6895;C12N15/11;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 趙蕊紅

本發(fā)明公開了第101位點(diǎn)發(fā)生突變的橡膠樹EPSPS基因及其檢測方法和應(yīng)用，第101位點(diǎn)發(fā)生突變的橡膠樹EPSPS基因經(jīng)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證是草甘膦的抗性基因，主要表現(xiàn)在莽草酸含量提高和種子重量提高；所發(fā)生的突變是101位氨基酸由G突變成A，本發(fā)明提供的EPSPS突變基因?yàn)榻沂局参锊莞熟⑺幒C(jī)制和轉(zhuǎn)基因檢測提供依據(jù)；本發(fā)明提供的EPSPS基因點(diǎn)突變的檢測方法，可以快速準(zhǔn)確經(jīng)濟(jì)地分析HbEPSPS基因突變信息，可用于草甘膦靶標(biāo)HbEPSPS檢測和分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)藥學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及第101位點(diǎn)發(fā)生突變的橡膠樹EPSPS基因及其檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

Monsanto公司在1971年開發(fā)出廣譜滅生性的除草劑草甘膦(Glyphosate)，商品名為農(nóng)達(dá)。草甘膦為滅生性除草劑，是目前應(yīng)用較廣銷售量較大的一類有機(jī)磷農(nóng)藥，具有高效性與廣譜性。因其能有效治理田間單子葉和雙子葉、一年生和多年生雜草而被廣泛大量使用。田間施藥過程中，由于施藥不準(zhǔn)確和藥劑漂移等原因常會造成經(jīng)濟(jì)作物藥害。

草甘膦主要通過抑制植物體內(nèi)莽草酸途徑中5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，阻礙植物合成苯丙氨酸、蘇氨酸及酪氨酸，抑制合成植保素等植物次生代謝物，影響植物正常生理生化反應(yīng)，嚴(yán)重可導(dǎo)致植物死亡。草甘膦作用的關(guān)鍵位點(diǎn)是EPSPS蛋白，研究證明了B.diandrus對草甘膦比野生型植物高出近五倍的遺傳抗性是由于EPSPS基因擴(kuò)增引起的。將EPSPS基因的T-DNA轉(zhuǎn)化導(dǎo)入水稻中產(chǎn)生抗草甘膦水稻。轉(zhuǎn)草甘膦耐受基因G2-EPSPS大豆顯示出對草甘膦的高耐受性。通過轉(zhuǎn)入表達(dá)密碼子修飾的CP4-EPSPS使轉(zhuǎn)基因水稻獲得5倍致死劑量的草甘膦抗性。采用定點(diǎn)突變EPSPS中T42M，發(fā)現(xiàn)能夠增加草甘膦抗性。說明通過篩選EPEPS點(diǎn)突變基因來篩選草甘膦抗性植株是直接有效的。此外，在擬南芥中采用定點(diǎn)突變EPSPS基因的方法使得轉(zhuǎn)基因植株獲得抗草甘膦性狀。許多高等植物、細(xì)菌均含有3個保守結(jié)構(gòu)域，改變其中一點(diǎn)可改變酶的活性和草甘膦的抑制作用。在橡膠樹中，發(fā)現(xiàn)草甘膦能破壞橡膠樹葉片葉綠體結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致抗氧化酶活性增加及可溶性糖含量下降。噴施植物逆境脫落酸(ABA)能夠顯著緩解橡膠樹幼苗由草甘膦造成的藥害。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)尚未有橡膠樹草甘膦抗性相關(guān)的EPSPS點(diǎn)突變技術(shù)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一個橡膠樹5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(HbEPSPS)的突變基因，即第101位點(diǎn)發(fā)生突變的橡膠樹EPSPS基因，證明轉(zhuǎn)點(diǎn)突變基因擬南芥具有對草甘膦抗性提高功的能；

本發(fā)明的第二目的在于提供一種EPSPS基因的點(diǎn)突變擴(kuò)增引物；

本發(fā)明的第三目的在于提供一種EPSPS基因點(diǎn)突變的檢測方法；

本發(fā)明的第四目的在于提供一種EPSPS點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種EPSPS突變基因，EPSPS基因在101位點(diǎn)的氨基酸由G突變成A，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

EPSPS突變基因在制備用于檢測植物樣品中草甘膦抗性試劑盒中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述植物為橡膠樹或擬南芥。

一種EPSPS基因的點(diǎn)突變擴(kuò)增引物，所述點(diǎn)突變擴(kuò)增引物為HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R，HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQ?ID?NO：6所示，HbEPSPS-G101A-R的序列如SEQ?ID?NO：7所示，具體為：

HbEPSPS-G101A-F：5’-TACCGTCTACTTGCCGGCTTCCAAGTCTCT-3’，

HbEPSPS-G101A-R：5’-GCCGGCAAGTAGACGGTACCGGAGATTT-3’。

一種EPSP基因點(diǎn)突變的檢測方法，它包括以下步驟：