[發明專利]第101位點發生突變的橡膠樹EPSPS基因及其檢測方法和應用

有效

• 申請號: 202010357066.1
• 申請日: 2020-04-29
• 公開（公告）號: CN111500603B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 張宇;王萌;李曉娜;肖厚貞;張冬
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12Q1/6895;C12N15/11;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 趙蕊紅

1.一種EPSPS突變基因，其特征在于EPSPS基因編碼蛋白在101位點的氨基酸由G突變成A，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.權利要求1所述EPSPS突變基因在制備用于檢測植物樣品中草甘膦抗性試劑盒中的應用，所述植物為橡膠樹或擬南芥。

3.一種EPSPS基因的點突變擴增引物，其特征在于，所述點突變擴增引物為HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R，HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQ?ID?NO：6所示，HbEPSPS-G101A-R的序列如SEQ?ID?NO：7所示。

4.一種如權利要求1所述的EPSP突變基因的檢測方法，其特征在于，它包括以下步驟：

S1.提取橡膠樹葉片中的總RNA，反轉錄得到cDNA第一鏈；

S2.以cDNA第一鏈為模板，HbEPSPS-F和HbEPSPS-R為引物，通過PCR擴增反應獲得橡膠樹HbEPSPS基因的cDNA序列；

其中，所述引物HbEPSPS-F的序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述引物HbEPSPS-R的序列如SEQ?ID?NO：3所示；

S3.將通過PCR擴增反應獲得的HbEPSPS基因的cDNA片段連接至pMD18-T載體中，并轉化大腸桿菌DH5α菌株中進行克隆和測序驗證；

S4.以cDNA第一鏈為模板，HbEPSPS-HindIII-F和HbEPSPS-BamHI-R為引物采用PCR技術擴增和產物膠回收；

其中，所述引物HbEPSPS-HindIII-F的序列如SEQ?ID?NO：4所示，所述引物HbEPSPS-BamHI-R的序列如SEQ?ID?NO：5所示；

S5.將步驟S4回收的產物連接到pMD18T載體，轉化大腸桿菌E.coli?DH5α感受態；

S6.重組子篩選，菌落PCR和測序鑒定。

5.一種如權利要求1所述的EPSPS突變基因的轉基因植株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.提取橡膠樹葉片中的總RNA，反轉錄得到cDNA第一鏈；

S2.以cDNA第一鏈為模板，HbEPSPS-F和HbEPSPS-R為引物，通過PCR擴增反應獲得橡膠樹HbEPSPS基因的cDNA序列；

其中，所述引物HbEPSPS-F的序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述引物HbEPSPS-R的序列如SEQ?ID?NO：3所示；

S3.將通過PCR擴增反應獲得的HbEPSPS基因的cDNA片段連接至pMD18-T載體中并轉化大腸桿菌DH5α菌株中進行克隆和測序驗證，測序驗證正確的質粒命名為HbEPSPS-18T；

S4.以HbEPSPS-18T為模版，采用點突變引物HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R為引物PCR擴增反應獲得HbEPSPS基因的cDNA序列，并將其cDNA片段連接至pMD18-T載體中并轉化大腸桿菌DH5α菌株中進行克隆和測序驗證，測序驗證正確的質粒命名為HbEPSPS-G101A-18T；

其中，所述點突變引物HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQ?ID?NO：6所示，所述點突變引物HbEPSPS-G101A-R的序列如SEQ?ID?NO：7所示；

S5.以HbEPSPS-G101A-18T為模版，帶有酶切位點的引物HbEPSPS-HindIII-F和HbEPSPS-BamHI-R擴增cDNA序列，其中，所述引物HbEPSPS-HindIII-F的序列如SEQ?IDNO：4所示，所述引物HbEPSPS-BamHI-R的序列如SEQ?ID?NO：5所示，利用電擊法將帶有HbEPSPS基因cDNA序列的質粒轉化農桿菌并轉化目標植物擬南芥野生型Col-0，獲得轉基因穩定遺傳擬南芥植株。

6.根據權利要求5所述的一種構建方法，其特征在于，步驟S2中擴增PCR儀反應程序如下：94℃預變性3min然后，94℃條件下變性30s，50℃條件下退火50s；72℃條件下延伸2min30s；循環35次，最后72℃延伸10min，4℃保存。