[發明專利]蘇云金芽孢桿菌Cry2A毒素的單克隆抗體及其應用

有效

• 申請號: 202010350203.9
• 申請日: 2020-04-28
• 公開（公告）號: CN111363722B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 劉賢金;李懿航;范榮榮;劉媛;郝佳
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/68;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 楊文晰

本發明公開一種用于Bt Cry2A毒素檢測的抗體制備方法及其應用，該抗體是通過免疫Balb/c小鼠后，獲得保藏號為CCTCC NO：C2019188雜交瘤細胞分泌產生；本申請同時提供了基于此抗體建立DAS?ELISA檢測方法，該方法最低檢測限為10.76ng/ml，對基于50μg/ml的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F毒素的交叉反應率小于0.1％，與Cry1B毒素的交叉反應率為3.2％，特異性較強，可用于Cry2A毒素的快速檢測，彌補了Cry2A毒素檢測領域的空白。

技術領域

本發明涉及一種轉基因植物中常見的蘇云金芽孢桿菌Cry2A毒素的單克隆抗體及其應用，可用于制備檢測轉基因植物中常見的Cry2A毒素的試劑盒，屬于生物技術領域。

背景技術

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，BT)，是一種包含許多變種的產晶體芽孢桿菌，屬于革蘭氏陽性菌。BT Cry毒素因其具有對靶標昆蟲特異性高、對人畜和有益生物安全、對環境無污染等優勢被廣泛應用于農業生產中，但近年來轉Bt基因抗蟲植物的使用，人們對于它的環境生態安全和安全隱患問題的擔憂逐漸增加。目前對于轉Bt基因植物的檢測，主要針對重組DNA和Cry毒素蛋白。

目前普遍接受的用于準確和特異性檢測轉Bt基因植物的方法主要有PCR、實時PCR、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、ELISA和膠體金免疫層析試紙條等。然而，雖然PCR方法具有較高的靈敏度和特異性，但不能測定出Cry毒素的表達水平，另外耗時較長，需要由專業人員操作特定的儀器。而對于HPLC測定方法，它需要用到昂貴的儀器，花費比較高，而且需要受過培訓的專業人員操作，前處理復雜，耗費時間長，不能用于快速田間檢測。而免疫學檢測方法，如ELISA和膠體金免疫層析試紙條，操作簡單，不需要昂貴的儀器，在短時間內就可以定量或半定量的檢測出目標蛋白。

免疫學檢測技術主要是以抗原抗體的特異性反應為基礎建立起來的，抗原-抗體反應，即抗原和抗體之間的特異性反應。免疫學測定也存在競爭和非競爭兩種形式。非競爭免疫檢測技術是較競爭免疫技術更優越的一種模式，具有更高的特異性，更高的靈敏度和更少的抗原用量。

DAS-ELISA(雙夾心ELISA檢測)是在Bt Cry毒素檢測中應用最為廣泛的方法，其中被分析物夾在捕獲抗體和檢測抗體之間。目前許多基于DAS-ELISA的檢測方法都已應用到Cry毒素的檢測當中，如Cry1Ab，Cry1Ac等。2015年武愛華等從噬菌體展示十二肽中篩選獲得能夠特異性結合Cry2A的十二肽，并基于此十二肽建立了檢測Cry2A毒素的間接競爭ELISA方法。然而由于共性結構的存在，對于某種Bt毒素檢測的單克隆抗體對其他毒素具有一定的交叉反應。(Roda et.Development and validation of a sensitive and fastchemiluminescent enzyme immunoassay for the detection of genetically modifiedmaize,2006；Zhang rt ai.Rapid isolation of single-chain antibodies from ahuman synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis(Bt)Cry1B toxin,2012)。目前，已存在Cry1A類檢測方法(Dongsa et al.Production andCharacterization of Monoclonal Antibody Broadly Recognizing Cry1 Toxins byUse of Designed Polypeptide as Hapten，2016)，但針對Cry2A毒素的單克隆抗體檢測方法尚未見報道。

發明內容