[發明專利]一種畢赤酵母EHT1基因過表達及敲除菌株構建的實驗方法

在審

• 申請號: 202010347630.1
• 申請日: 2020-04-28
• 公開（公告）號: CN111500618A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 陳嘉;施俊鳳;馮志宏;杜婧婷;張新憲;田倩;趙琳;白宇皓;張立新;閆釗
• 申請（專利權）人: 山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/55;C12N9/16;C12Q1/44;C12Q1/686;C12R1/84
• 代理公司: 北京集智東方知識產權代理有限公司 11578
• 代理人: 吳倩

本發明適用于基因作用機制檢測的技術領域，提供了一種畢赤酵母EHT1基因過表達及敲除菌株構建的實驗方法，通過構建畢赤酵母的EHT1基因表達菌株、設計和合成EHT1引物、提取畢赤酵母菌體的質粒、線性化質粒及制備畢赤酵母感受態、構建敲除EHT1基因的畢赤酵母菌株、EHT1基因的敲除和轉化、鑒定畢赤酵母EHT1基因是否敲除、設計及合成EHT1檢測引物、利用qRT?PCR檢測EHT1的mRNA、SPME GC?MS酶活性分析，從而檢測EHT1基因對于畢赤酵母發酵產物中揮發性脂肪酸的產生的作用，為進一步研究醇酰基轉移酶的表達和酯酶活力，揭示畢赤酵母EHT1基因作用機制提供理論依據。

技術領域

本發明屬于基因作用機制檢測的技術領域，尤其涉及一種畢赤酵母EHT1基因過表達及敲除菌株構建的實驗方法。

背景技術

HT1對短鏈脂肪酸酯的合成起到更大的控制作用。對從各種食品中分離到的酵母菌株進行揮發性香氣成分檢測，發現可以產生多種酯類物質如辛酸乙酯和己酸乙酯等。分析酵母中控制酯類合成的酶發現EHT1和EEB1主要控制中短鏈的脂肪酸酯，前期研究EHT1和EEB1基因的分布發現EHT1基因在所有菌株中均存在，而EEB1基因只在部分酵母菌株中存在，推測EHT1基因是酵母合成酯類所必需基因。因此，通過過表達(OE)和敲除畢赤酵母內源性EHT1基因，檢測EHT1的mRNA和蛋白水平表達，Bradford法測定總蛋白量，對硝基苯基乙酸酯作為底物測定酯酶活性，SPME GC-MS檢測過表達和敲除菌株中揮發性脂肪酸的產生，從而為進一步研究醇酰基轉移酶的表達和酯酶活力，揭示畢赤酵母EHT1基因作用機制提供理論依據。

發明內容

本發明提供一種畢赤酵母EHT1基因過表達及敲除菌株構建的實驗方法，旨在為進一步研究醇酰基轉移酶的表達和酯酶活力，揭示畢赤酵母EHT1基因作用機制提供理論依據。

本發明是這樣實現的，一種畢赤酵母EHT1基因過表達及敲除菌株構建的實驗方法，包括以下步驟：

S1、構建畢赤酵母的EHT1基因表達菌株；

S11、設計和合成EHT1引物；

S12、提取畢赤酵母菌體的質粒；

S13、線性化質粒及制備畢赤酵母感受態；

S14、電轉化EHT1/pPIC9k質粒；

S2、構建敲除EHT1基因的畢赤酵母菌株；

S21、EHT1基因的敲除和轉化；

S22、鑒定畢赤酵母EHT1基因是否敲除；

S23、設計及合成EHT1檢測引物；

S24、利用qRT-PCR檢測EHT1的mRNA；

S25、SPME GC-MS酶活性分析。

優選的，還包括：

步驟S3、結果分析；

S31、克隆EHT1基因和構建質粒；

S32、鑒定EHT1基因敲除DNA的水平；

S33、檢測EHT1過表達及敲除mRNA水平；

S34、檢測EHT1過表達敲除蛋白水平；

S35、測定酯酶活性；

S36、SPME GC-MS分析。