[發明專利]轉褐飛虱CYP6ER1基因的果蠅制備及其在殺蟲劑篩選中的應用

在審

• 申請號: 202010345970.0
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111518819A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 吳順凡;曾彬;高聰芬
• 申請（專利權）人: 南京吉星生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/85;A01K67/033
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 張鐵蘭

本發明涉及一種褐飛虱CYP6ER1基因在果蠅轉基因中的應用，本發明通過把褐飛虱CYP6ER1基因構建到果蠅中，利用果蠅GAL4/UAS二元表達系統，可在果蠅中過量表達CYP6ER1基因，該果蠅可用于測定CYP6ER1基因是否對常用的防治褐飛虱的殺蟲劑具有解毒代謝作用以明確其是否介導褐飛虱對殺蟲劑的抗性，同時該果蠅可用于新型殺蟲劑的篩選和開發。

技術領域

本發明涉及分子生物學，動物模型構建及其害蟲防治領域，具體地說，本發明涉及將褐飛虱體內的P450基因構建到果蠅體內，利用果蠅的GAL4/UAS二元表達系統建成一個可快速確定褐飛虱CYP6ER1基因與殺蟲劑抗性之間的相互作用關系及篩選防治褐飛虱新藥物的果蠅模型。

技術背景

褐飛虱(Nilaparvata lugens)是水稻生產上的重要害蟲，廣泛分布在中國、韓國、日本及菲律賓等亞洲國家中，其不僅通過取食水稻的液態營養物質造成直接為害，還能夠傳播水稻草狀矮縮病(Rice grassy stunt virus，RGSV)和水稻齒葉矮縮病(Rice raggedstunt virus，RRSV)等病毒病而導致水稻嚴重減產。褐飛虱是為害水稻的單食性害蟲，屬于典型的r-對策型，具有極高的內稟增長率和環境適應性，很容易爆發成災。中國從上世紀70年代開始褐飛虱的危害變得日趨嚴重，從局部危害成為稻區最主要的危害。1980以后，褐飛虱在我國每年的發生面積為1330～2000萬公頃，約占我國水稻種植面積的50％，年損失高達10～15億公斤。其中1987和1991年，褐飛虱對我國水稻的危害面積甚至高達2300萬公頃。進入21世紀后，2005年褐飛虱的特大爆發令人猝不及防，損失的稻谷高達20億公斤。直到現在，每年褐飛虱也給水稻生產造成巨大的經濟損失。

長期以來，褐飛虱的防治主要依賴化學藥劑的使用。從上世紀60年代開始，陸續的分別有有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、昆蟲生長調節劑、新煙堿類及吡啶類等藥劑被用于褐飛虱的防控，由于化學藥劑的大量且不規范使用，褐飛虱不可避免的會對這些藥劑產生抗性，也因此許多藥劑被逐漸減少直到現在停止用于褐飛虱的防治。當前，我國田間褐飛虱的防治主要依賴于吡蚜酮及新煙堿類藥劑，但根據近年來褐飛虱的田間監測結果顯示，它對絕大多數新煙堿類藥劑如吡蟲啉、噻蟲嗪、呋蟲胺、烯啶蟲胺、氟啶蟲胺腈及吡啶類藥劑吡蚜酮等都已達到中等至高水平抗性。

細胞色素P450單加氧酶是一個具有很多基因的超家族，它對殺蟲劑、植物毒素等外源物質的解毒代謝起著至關重要的作用。在昆蟲中，P450單加氧酶介導的解毒代謝是殺蟲劑抗性上升的主要機制之一，但它介導抗藥性的過程具有高度復雜性，若僅通過簡單的P450基因表達上調來判斷其介導了相應的抗性是不準確的，如吡蟲啉處理褐飛虱后，有18個P450基因被誘導上調，但體外表達實驗發現僅其中4個P450酶能代謝吡蟲啉，因此研究P450基因是否參與殺蟲劑的抗性，在發現基因表達上調后需要進一步確認其功能。CYP6ER1基因是來自褐飛虱體內的一個P450基因，許多研究發現CYP6ER1與褐飛虱對新煙堿類藥劑產生抗性密切相關，其中已證明了CYP6ER1表達的蛋白酶可將吡蟲啉代謝為其他的低毒物質，在褐飛虱抗性種群體內降低CYP6ER1的mRNA水平后，其對噻蟲嗪、噻蟲胺、氟啶蟲胺腈和烯啶蟲胺敏感性顯著增加，這表明CYP6ER1基因在褐飛虱對新煙堿類藥劑的抗性演化過程中扮演者及其重要的角色。由上述可知，褐飛虱對殺蟲劑的抗性演化速度極快，且抗性機制復雜多變，而其中CYP6ER1基因是一個關鍵基因，因此為更好的制定褐飛虱的抗性管理策略與田間用藥防治措施，很有必要建立一種快速準確的方法來確定褐飛虱CYP6ER1基因與常用殺蟲劑的抗性關系，同時也通過CYP6ER1基因篩選出對褐飛虱有防治效果的新型化合物。