[發明專利]轉褐飛虱CYP6ER1基因的果蠅制備及其在殺蟲劑篩選中的應用

在審

• 申請號: 202010345970.0
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111518819A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 吳順凡;曾彬;高聰芬
• 申請（專利權）人: 南京吉星生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/85;A01K67/033
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 張鐵蘭

1.一種褐飛虱CYP6ER1基因在轉基因果蠅中的構建及其應用。

2.根據權利要求1所述，其特征在于，包括以下步驟：

(1)轉基因果蠅的構建：在本發明中載體質粒為：pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8::GFP，選擇質粒上的XhoⅠ位點與XbaⅠ位點作為目的基因的插入位點，根據這兩個酶切位點及CYP6ER1基因的ORF兩端序列，設計一對上下游引物NlCYP6ER1-XhoI-F和NlCYP6ER1-XbaI-R，引物序列如下：

NlCYP6ER1-XhoI-F：5’-TTCAGGCGGCCGCGGctcgagCAAAATGTGGGAAAACTCGTGG-3’

NlCYP6ER1-XbaI-R：5’-CCTTCACAAAGATCCTctagaCTAAGTATCTCTTGCTATT-3’

以褐飛虱cDNA為模板，PCR釣取CYP6ER1基因的完整ORF序列，其堿基序列如SEQ IDNO.1所示，包括1521個核苷酸堿基，按照諾唯贊公司一步克隆試劑盒的說明書構建真核表達載體pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8::GFP-CYP6ER1，經PCR驗證和測序驗證插入該質粒中的CYP6ER1基因序列正確后，將該質粒注射到基因型為dPhiC31/Y；attP/+；+/+或dPhiC31/yw；attP/+；+/+的果蠅胚胎中，在PhiC31整合酶的作用下，質粒上的attB序列與果蠅中的attP序列特異性識別，將目的基因以單拷貝方式插入到果蠅Ⅱ染色體上，轉基因成功的果蠅將出現紅色的復眼；

(2)將紅眼轉基因果蠅與平衡系果蠅進行兩輪雜交，依據后代表型，挑選純合體轉基因果蠅UAS-NlCYP6ER1品系；

(3)利用UAS/GAL4系統，將步驟(2)制得的純合體轉基因果蠅與da-GAL4果蠅品系進行雜交，使得CYP6ER1基因在后代果蠅各細胞中表達，從而獲得過表達褐飛虱CYP6ER1的轉基因果蠅。

3.權利要求2中所用平衡系雜交果蠅，其基因型為：

4.權利要求2中最后篩選得到的純合體轉基因果蠅，其基因型為

5.權利要求2中所述的CYP6ER1基因表達的轉基因果蠅可用于常用殺蟲劑的抗性測定及新型化合物的篩選。