[發(fā)明專利]一種甲型/乙型流感病毒、新型冠狀病毒檢測方法與試劑盒

在審

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• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN113637795A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設計）人: 郭圣明;江永忠;夏懿
• 申請（專利權(quán)）人: 上海星耀醫(yī)學科技發(fā)展有限公司;湖北省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供一種甲型/乙型流感病毒、新型冠狀病毒檢測方法與試劑盒，該方法采用多對引物、多條探針的熒光核酸擴增方法，可在單管中實現(xiàn)多種靶核酸序列檢測。該發(fā)明分別以甲型流感病毒的M2基因、乙型流感病毒M2基因以及新型冠狀病毒ORF1ab基因、N基因為靶序列設計特異性引物和TaqMan探針，通過多通道熒光PCR擴增檢測甲型/乙型流感病毒和新型冠狀病毒。本發(fā)明優(yōu)化引物探針設計、反應體系和擴增程序，~70分鐘即可完成熒光檢測，試劑盒靈敏度達到200copies/mL。

技術(shù)領域

本發(fā)明為一種甲型/乙型流感病毒、新型冠狀病毒檢測方法與試劑盒，屬于生物技術(shù)領域。

背景技術(shù)

流行性感冒病毒（influenza virus），是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表種，簡稱流感病毒，包括人流感病毒和動物流感病毒，其中人類流感病毒根據(jù)其核蛋白的抗原性可以分為三類：甲（A）、乙（B）、丙（C）三種型別，是流行性感冒（流感）的病原體。其中甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行。例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000萬～4000萬人死于流感；乙型流感病毒對人類致病性也比較強，但是人們還沒有發(fā)現(xiàn)乙型流感病毒引起過世界性大流行；丙型流感病毒只引起人類不明顯的或輕微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分離成功，乙型流感病毒于1940年獲得，丙型流感病毒直到1949年才成功分離。

流感病毒呈球形，新分離的毒株則多呈絲狀，其直徑在80至120納米之間，絲狀流感病毒的長度可達4000納米。流感病毒結(jié)構(gòu)自外而內(nèi)可分為包膜、基質(zhì)蛋白以及核心三部分。病毒的核心包含了存貯病毒信息的遺傳物質(zhì)以及復制這些信息必須的酶。流感病毒的遺傳物質(zhì)是單股負鏈RNA，簡寫為ss-RNA，ss-RNA與核蛋白 (NP)相結(jié)合，纏繞成核糖核蛋白體，以密度極高的形式存在。除了核糖核蛋白體，還有負責RNA轉(zhuǎn)錄的RNA多聚酶。

甲型和乙型流感病毒的RNA由8個節(jié)段組成，丙型流感病毒則比它們少一個節(jié)段，第1、2、3個節(jié)段編碼的是RNA多聚集酶，第4個節(jié)段負責編碼血凝素；第5個節(jié)段負責編碼核蛋白，第6個節(jié)段編碼的是神經(jīng)氨酸酶；第7個節(jié)段編碼基質(zhì)蛋白，第8個節(jié)段編碼的是一種能起到拼接RNA功能的非結(jié)構(gòu)蛋白，這種蛋白的其他功能尚不得而知。丙型流感病毒缺少的是第六個節(jié)段，其第四節(jié)段編碼的血凝素可以同時行使神經(jīng)氨酸酶的功能。

基質(zhì)蛋白構(gòu)成了病毒的外殼骨架，實際上骨架中除了基質(zhì)蛋白 (M1)之外還有膜蛋白 (M2)。M2蛋白具有離子（主要是Na+）通道和調(diào)節(jié)膜內(nèi)PH值的作用，但數(shù)量很少。基質(zhì)蛋白與病毒最外層的包膜緊密結(jié)合起到保護病毒核心和維系病毒空間結(jié)構(gòu)的作用。當流感病毒在宿主細胞內(nèi)完成其繁殖之后，基質(zhì)蛋白是分布在宿主細胞細胞膜內(nèi)壁上的，成型的病毒核衣殼能夠識別宿主細胞膜上含有基質(zhì)蛋白的部位，與之結(jié)合形成病毒結(jié)構(gòu)，并以出芽的形式突出釋放成熟病毒。

包膜是包裹在基質(zhì)蛋白之外的一層磷脂雙分子層膜，這層膜來源于宿主的細胞膜，成熟的流感病毒從宿主細胞出芽，將宿主的細胞膜包裹在自己身上之后脫離細胞，去感染下一個目標。包膜中除了磷脂分子之外，還有兩種非常重要的糖蛋白：血凝素和神經(jīng)氨酸酶。這兩類蛋白突出病毒體外，長度約為10至40納米，被稱作刺突。一般一個流感病毒表面會分布有500個血凝素刺突和100個神經(jīng)氨酸酶刺突。在甲型流感病毒中血凝素和神經(jīng)氨酸酶的抗原性會發(fā)生變化，這是區(qū)分病毒毒株亞型的依據(jù)。

流感病毒感染具有自限性，但在嬰幼兒、老年人和存在心肺基礎疾病的患者容易并發(fā)肺炎等嚴重并發(fā)癥而導致死亡。一般出現(xiàn)于冬季，北半球通常在1、2月份達到高峰，南半球的流行時間較晚，熱帶地區(qū)可常年發(fā)病。世界性大流行常有2～3個流行波，一般流行3～4周會自然停止。世界衛(wèi)生組織估計北半球每年1億人感染流感，5000萬次就診，30萬次住院，主要是高危人群和老年人，每年1萬人死于流感，主要是虛弱的老年人。