[發明專利]快速檢測THRA基因突變的引物組以及檢測方法

在審

• 申請號: 202010344932.3
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111440853A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 彭南求;陳林軍;錢芝網
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及快速檢測THRA基因突變的引物組以及檢測方法，屬于生物技術和醫學領域。在THRA基因突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物；本發明設計了THRA第3號外顯子的野生型引物和突變型引物，分別擴增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物對兩種突變型片段進行PCR擴增，擴增對應的突變型模板；不同比例混合野生型模板和突變型模板，用HRM方法進行區分。與現有技術相比，本發明方法具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優點；而且通量更高，單次成本更低。

技術領域

本發明屬于生物技術和醫學領域，尤其是涉及快速檢測THRA基因突變的引物組以及檢測方法。

背景技術

人THRA(Thyroid Hormone Receptor Alpha)基因，定位于人染色體17q21.1的位置。編碼蛋白THRA由490個氨基酸組成，分子量約54kDa。THRA蛋白是一個三碘甲狀腺原氨酸核激素受體。屬于甲狀腺激素的幾個受體之一，研究表明它介導了甲狀腺激素的生物學活力。小鼠敲除實驗表明存在幾種不同的受體形式，相互之間具有一定的冗余性，可能介導甲狀腺激素不同的功能。另外，也有研究報道由不同剪切的轉錄變體編碼不同的同分異構體。

THRA基因位點的突變與很多疾病的發生發展相關，包括甲狀腺癌、甲狀腺功能減退、先天性甲狀腺機能低下等，這些位點上的突變是細胞惡性轉化及可能的腫瘤產生的預兆，應引起高度重視。因此，關于THRA基因位點突變的檢測有著非常重要的作用。

眾所周知，高分辨熔解曲線(high-resolution melt，HRM)分析技術是近幾年來在國外興起的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學分析方法。它是一種高效穩健的PCR技術，不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR(Polymerase ChainReaction)即聚合酶鏈式反應結束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作簡便快速，使用成本低，結果準確，實現了真正的閉管操作，HRM技術受到普遍關注。而，高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統的熔解曲線分析的延伸：它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR與專門的分析算法；使我們可以不必測序直接篩查PCR擴增產物中是否存在遺傳學變異(SNPs,mutations)。SYBR^TMGreen I對PCR擴增有毒性，因此必需使用低濃度的染料，又因為它是非飽和態結合，染料在熔解過程中可重新結合，使其無法適用于HRM。

與此同時，羅氏開發了一種新的適用于HRM的染料ResoLight或LC Green，它有三個優點：1、飽和染料毒性低；2、濃度可以使DNA達到飽和；3、降低了染料位置重組的可能。而，PCR(Polymerase Chain Reaction)產物的高分辨率熔解曲線HRM的要求：儀器：高分辨率高、均一性的儀器，確保結果差異僅受DNA模板的影響；試劑：穩定可靠的PCR與HRM染料，確保獲取高分辨率熔解曲線；軟件：高分辨率熔解曲線分析專用軟件。羅氏熒光定量PCR系統LightCycler Nano System具有光源好、溫控好、檢測好、加熱快的優點，完全能滿足檢測的要求，這臺儀器也于近期通過了國家藥監局的審批，適用于臨床診斷檢測。LightCyclerNano System是LightCycler 480System的縮小版，480在HRM領域發表的文獻是當前發表文獻最多的實時定量PCR系統：應用領域包括人類疾病、植物、微生物、病毒、藥理、毒理、生理、診斷等影響因子10分以上5篇，包括Nature,Nature Methods,NatureGenetics，影響因子5－10分10篇，5分以上文章占總數的18％逐年上升趨勢明顯，已經成為當前qPCR擴展應用的熱點目前常常使用測序法來檢測是否存在突變，但是總結下來，現有的測序法有三個缺點：

第一：靈敏度不高，低比例突變(20％)無法檢測；

第二：耗時長，一般需要2-3天；

第三：成本高。

發明內容