[發明專利]快速檢測THRA基因突變的引物組以及檢測方法

在審

• 申請號: 202010344932.3
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111440853A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 彭南求;陳林軍;錢芝網
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種快速檢測THRA基因突變的引物組，其特征在于，包括THRA第3號外顯子的野生型引物和突變型引物，

野生型引物分別為：

THRA-E3 F：序列如SEQ ID NO.1所示，

THRA-E3 R：序列如SEQ ID NO.2所示；

突變型引物分別為

THRA-E3 K74E F：序列如SEQ ID NO.3所示，

THRA-E3 K74E R：序列如SEQ ID NO.4所示。

2.THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

在THRA基因突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物；

分別擴增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物對兩種突變型片段進行PCR擴增，擴增對應的突變型模板；

不同比例混合野生型模板和突變型模板，用HRM方法進行區分；

野生型引物分別為：

THRA-E3 F：序列如SEQ ID NO.1所示，

THRA-E3 R：序列如SEQ ID NO.2所示；

突變型引物分別為

THRA-E3 K74E F：序列如SEQ ID NO.3所示，

THRA-E3 K74E R：序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根據權利要求2所述THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，所述PCR產物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產物的Tm取決于GC含量，

高Tm G:CA:TG:GG:T＝G:AT:T＝A:AT:CA:CC:C低Tm。

4.根據權利要求2所述THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，純合子包括野生型純合子或突變純合子，純合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線。

5.根據權利要求2所述THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，所述不同比例混合這兩種模板，使突變型模板的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進行區分。

6.根據權利要求2所述THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，突變型模板的獲取包括：利用帶有突變位點的突變引物獲得突變位點前后兩段突變片段；將這兩段突變片段連接起來，構成THRA-E3突變型模板。

7.根據權利要求2所述THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，野生型模板的獲取包括：以已知未突變基因組為模板，THRA-E3 F+THRA-E3 R為引物進行實驗，獲得條帶單一的特異性野生型模板。

8.根據權利要求2所述THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

樣本處理：取外周血于EDTA抗凝管中，顛倒混勻，保存；

DNA提取：取抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測；

qPCR-HRM檢測，包括：對照孔的設立和檢測重復孔；反應體系構成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統儀器中進行程序性檢測；

結果分析及判定：在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對照孔的判定為突變型，差異小于陽性對照孔的判定為野生型。

9.根據權利要求8所述THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，所述qPCR-HRM檢測的程序包括：95℃變性10分鐘；95℃變性10秒鐘；退火采用探底式，設置探底退火溫度為55-65℃，每個循環降低1℃，時間為10秒鐘；72℃延伸30秒鐘；重復第2步到第四步45個循環；95℃變性60秒鐘；40℃變性60秒鐘；設置高分辨率熔解溫度從60℃到95℃，緩變率是0.05℃/s。

10.根據權利要求8所述THRA基因突變的檢測方法，其特征在于，通過各孔的熔解曲線圖查看各孔PCR條帶特異性，以野生型樣品孔為基線。