[發(fā)明專利]雞球蟲多價重組蛋白疫苗及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010344564.2
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111514284A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉群;楊旭;陳慶忠;宋星桔;劉晶;安同偉;許建海
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A61K39/012
• 分類號: A61K39/012;A61P33/02;C12N15/11;C12N15/66;C12N15/70;C07K16/20;C07K16/06
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279
• 代理人: 賈慧娜;王芊雨

1.一種雞球蟲多價重組蛋白疫苗，其特征在于，包含4種雞球蟲重組蛋白：柔嫩艾美耳球蟲棒狀體蛋白41、柔嫩艾美耳球蟲配子體蛋白22、巨型艾美耳球蟲配子體蛋白56、和堆型艾美耳球蟲裂殖子蛋白Ea3-1E，所述4種雞球蟲重組蛋白均為原核表達(dá)，依次具有如SEQ IDNO.1-4所示的氨基酸序列，并按照1:1:1:1的質(zhì)量比例混合。

2.如權(quán)利要求1所述的雞球蟲多價重組蛋白疫苗，其特征在于，所述4種雞球蟲重組蛋白依次具有如SEQ ID NO.5-8所示的核苷酸序列。

3.用于擴(kuò)增權(quán)利要求2所述的核苷酸序列的引物，其特征在于，具有以下序列：

擴(kuò)增EtROP41上游引物：

5’-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGAACCTCCCCGAGTCAACCT-3’(SEQ ID NO.9)，

擴(kuò)增EtROP41下游引物：

5’-CACGATGCGGCCGCTCGAGATCCTGGAACTCCCTGGACACC-3’(SEQ ID NO.10)；

擴(kuò)增EtGAM22上游引物：

5’-CAAGGCCATGGCTGATATCGGCACCTGAGTATCCTTCTCAGCTTG-3’(SEQ ID NO.11)，

擴(kuò)增EtGAM22下游引物：

5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTGTTGATGTCGGTAGGCTGCTCTTCC-3’(SEQ ID NO.12)；

擴(kuò)增EmGAM56上游引物：

5’-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCAGGTTCACCCTTACAGCGAG-3’(SEQ ID NO.13)，

擴(kuò)增EmGAM56下游引物：

5’-CGTCTCCGCTCTTTGGCAACCTCGAGCGGCCGCATCGTG-3’(SEQ ID NO.14)；

擴(kuò)增Ea3-1E上游引物：

5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3’(SEQ ID NO.15)，

擴(kuò)增Ea3-1E下游引物：

5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGAAGCCGCCCTGGTACAGGT-3’(SEQ ID NO.16)。

4.一種雞球蟲多價重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

基因擴(kuò)增：分別以柔嫩艾美耳球蟲棒狀體蛋白41、柔嫩艾美耳球蟲配子體蛋白22、巨型艾美耳球蟲配子體蛋白56、和堆型艾美耳球蟲裂殖子蛋白Ea3-1E的cDNA序列為模板，通過權(quán)利要求3所述的引物分別進(jìn)行基因擴(kuò)增；

重組載體構(gòu)建：將擴(kuò)增出的EtROP41基因序列與pGEX-6p-1骨架構(gòu)建重組載體，將擴(kuò)增出的EtGAM22基因序列與pET-28a骨架構(gòu)建重組載體，將擴(kuò)增出的EmGAM56基因序列與pGEX-6p-1骨架構(gòu)建重組載體，將擴(kuò)增出的Ea3-1E基因序列與pET-28a骨架構(gòu)建重組載體；

重組蛋白表達(dá)：將上述4種重組載體分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌，通過IPTG分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化；以及

混合：將誘導(dǎo)表達(dá)完成的4種雞球蟲重組蛋白進(jìn)行等質(zhì)量混合，即得。

5.如權(quán)利要求4所述的雞球蟲多價重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)菌為E.coliTransetta(DE3)菌株；所述柔嫩艾美耳球蟲棒狀體蛋白41、柔嫩艾美耳球蟲配子體蛋白22、和堆型艾美耳球蟲裂殖子蛋白Ea3-1E的誘導(dǎo)表達(dá)條件均為37℃誘導(dǎo)12h，所述巨型艾美耳球蟲配子體蛋白56的誘導(dǎo)表達(dá)條件為18℃誘導(dǎo)18h。

6.一種能夠與權(quán)利要求1所述的雞球蟲多價重組蛋白疫苗特異性結(jié)合的抗體或血清。

7.權(quán)利要求1所述的雞球蟲多價重組蛋白疫苗在雞球蟲母源免疫以及制備治療后代雛雞抗球蟲藥物中的應(yīng)用。

8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述雞球蟲多價重組蛋白疫苗與佐劑共同使用，所述雞球蟲多價重組蛋白疫苗與佐劑為等質(zhì)量混合。