[發明專利]高效表達鵝星狀病毒可溶性衣殼蛋白的ORF2基因的方法及其應用

有效

• 申請號: 202010344174.5
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111471701B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 張凌云;張博;謝田田;閆召璐;趙遠菲;耿彥杰;鄭杰;馬寧寧
• 申請（專利權）人: 浙江鼎持生物制品有限公司;北京鼎持生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/40;C07K14/08;C07K1/22;A61K39/12;A61K39/42;A61P31/14;C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 北京金宏來專利代理事務所(特殊普通合伙) 11641
• 代理人: 左海明

本發明涉及一種高效表達鵝星狀病毒可溶性衣殼蛋白的ORF2基因的方法及其應用，屬于獸用生物制品領域。本發明將鵝星狀病毒的ORF2基因根據基因序列功能的不同分為兩段表達，表達產物分別為衣殼蛋白capsid precursor(簡稱cap)和刺突蛋白capsid spike(簡稱spike)。根據功能區進行分割的兩段蛋白可用大腸桿菌、桿狀病毒和CHO表達系統進行表達。通過純化方法獲得鵝星狀病毒的capsid precursor表達蛋白和capsid spike表達蛋白。表達的衣殼蛋白(capsid precursor)和刺突蛋白(capsid spike)蛋白可用于制備鵝星狀病毒亞單位疫苗和卵黃抗體。本發明制備的亞單位疫苗和卵黃抗體具有很好的免疫效果和治療效果，可應用于預防鵝星狀病毒引起的疾病，并具有生產成本低、操作簡單、生物安全性好的優點。

技術領域

本發明涉及獸用生物制品技術領域，具體涉及一種高效表達鵝星狀病毒可溶性衣殼蛋白的ORF2基因的方法及其應用。

背景技術

鵝星狀病毒(Goose Astrovirus，GAstV)是引起三周齡以內的雛鵝，發生高致死性內臟痛風病的一種星狀病毒。其發病特點是：鵝群感染GAstV后，以組織器官及腿部肌肉、關節覆蓋大量尿酸鹽沉淀物為主要特征，發病率達50％以上，致死率可達30％以上，對三周齡以內的雛鵝具有較強感染性。感染后康復鵝易產生免疫抑制。其主要臨床癥狀包括精神沉郁，食欲不振，腹瀉，生長不良，還可導致肝炎、腎炎等疾病。死亡雛鵝剖檢可發現腎小管上皮細胞損傷，心臟、肝臟、肺臟、腿肌、胸肌等部位出現嚴重的尿酸鹽沉積，非化膿性腦炎等特征。雛鵝早期感染GAstV出現活動減少、四肢癱瘓、精神沉郁的癥狀。感染GAstV的雛鵝很快即可出現死亡。感染后的雛鵝通過排糞等途徑持續排毒，經糞口傳播，難以控制傳染源。GAstV給養禽業帶來了巨大的經濟損失。

現有技術防控GAstV的主要方法仍然是延長空舍時間、消毒及隔離等手段，沒有相關預防和治療性產品。因此，亟需開發研制新型有效的疫苗和卵黃抗體以達到有效防治該類傳染病之目的。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明專利設計了一種能高效表達鵝星狀病毒ORF2基因的方法，并利用該方法制備了一種能夠有效預防鵝星狀病毒感染的疫苗和卵黃抗體，為防治鵝星狀病毒提供保障。首先，本發明設計了一種能將鵝星狀病毒衣殼蛋白高效表達的方法。為能將ORF2基因表達出正確的結構，根據序列結構的功能分為兩段表達，表達產物分別為astrovirus capsid precursor(簡稱cap)和capsid spike(簡稱spike)。表達后的蛋白分別形成具有衣殼蛋白和刺突蛋白的表面免疫原性結構域。包括以下步驟，

(1)ORF2基因的合成，參照鵝星狀病毒株ORF2基因序列，對序列進行大腸桿菌的密碼子偏嗜性優化，人工合成ORF2基因如SEQ ID NO.1所示，連入載體得pUC57-ORF2；

(2)克隆基因的設計及PCR擴增，將ORF2基因根據編碼的蛋白的功能不同將其分為衣殼蛋白39nt～406nt和刺突蛋白394nt～665nt兩段分別進行載體構建和表達；所述衣殼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述刺突蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)擴增片段分別連接pET28a載體，將衣殼蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段切膠后用DNA純化回收試劑盒回收，從重組菌株DH5α-pET28a中提取質粒pET28a，將提取的pET28a載體質粒與純化回收的衣殼蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段均分別用BamHI和NotI進行雙酶切；將回收后的pET28a質粒、衣殼蛋白DNA片段(cap)和刺突蛋白DNA片段(spike)用T4 DNA Ligase連接質粒和片段，構建重組質粒pET28a-cap和pET28a-spike；