[發明專利]高效表達鵝星狀病毒可溶性衣殼蛋白的ORF2基因的方法及其應用

有效

• 申請號: 202010344174.5
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111471701B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 張凌云;張博;謝田田;閆召璐;趙遠菲;耿彥杰;鄭杰;馬寧寧
• 申請（專利權）人: 浙江鼎持生物制品有限公司;北京鼎持生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/40;C07K14/08;C07K1/22;A61K39/12;A61K39/42;A61P31/14;C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 北京金宏來專利代理事務所(特殊普通合伙) 11641
• 代理人: 左海明

1.高效表達鵝星狀病毒可溶性衣殼蛋白的ORF2基因的方法，其特征在于，將鵝星狀病毒可溶性衣殼蛋白的ORF2基因進行分段表達，包括以下步驟，

(1)ORF2基因的合成，參照鵝星狀病毒株ORF2基因序列，對序列進行大腸桿菌的密碼子偏嗜性優化，人工合成ORF2基因，如SEQ ID NO.1所示，連入載體得pUC57-ORF2；

(2)克隆基因的設計及PCR擴增，將ORF2基因根據編碼的蛋白的功能不同將其分為衣殼蛋白39nt～406nt和刺突蛋白394nt～665nt兩段分別進行載體構建和表達；所述衣殼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述刺突蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)擴增片段分別連接pET28a載體，將衣殼蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段切膠后用DNA純化回收試劑盒回收，從重組菌株DH5α-pET28a中提取質粒pET28a，將提取的pET28a載體質粒與純化回收的衣殼蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段均分別用BamHI和NotI進行雙酶切；將回收后的pET28a質粒、衣殼蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段用T4 DNA Ligase連接質粒和片段，構建重組質粒pET28a-cap和pET28a-spike；

(4)重組質粒的轉化，衣殼蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段分別與pET28a的連接產物轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞，將轉化菌液涂布于固體LB瓊脂平板，再將LB瓊脂平板放于37℃溫箱中過夜培養；待LB平板上長出單克隆菌體后，挑出單菌落活化于LB液體，取微量菌液進行PCR鑒定，余下部分菌液用于提取重組質粒進行雙酶切鑒定；

(5)重組菌株的構建與表達，將鑒定正確的重組質粒pET28a-cap和pET28a-spike分別轉化至大腸桿菌BL21-DE3-pLysS，構建重組表達菌株BL21-DE3-pLysS-pET28a-cap和BL21-DE3-pLysS-pET28a-spike，將BL21-DE3-pLysS-pET28a-cap和BL21-DE3-pLysS-pET28a-spike分別活化后，按1：100的比例接種至液體TB培養基中，置于37℃搖床培養3h，加入IPTG至終濃度0.5mM，過夜誘導后將菌液離心，去掉TB上清，余下菌體用PBS重懸超聲破碎，將超聲菌體離心分離上清和沉淀，利用SDS-PAGE和Western Blot進行可溶性分析。

2.根據權利要求1所述的高效表達鵝星狀病毒可溶性衣殼蛋白的ORF2基因的方法，其特征在于，所述步驟(2)中克隆基因的設計及PCR擴增的方法為，根據核苷酸序列分別設計引物進行基因擴增，引物序列為Seg1-F CGCGGATCCCAGAAACTGCCGATGAAAGCTGAAC；Seg1-RAAAAGGAAAAGCGGCCGCGCCCTGACCAGTGGTGTTAACGTTC用于擴增368個氨基酸的衣殼蛋白；Seg2-F CGCGGATCCATGCAGGTGACCCCGAGCCT；Seg2-R AAAAGGAAAAGCGGCCGCGCTGGTTTTCAGGCTCACCGCCA用于擴增272個氨基酸的刺突蛋白；在上游引物Seg1-F和Seg2-F的5’端引入限制性酶切位點BamHI，在下游引物Seg1-R和Seg2-R的5’端引入限制性酶切位點NotI；分別以Seg1-F，Seg1-R為引物，以pUC57-ORF2為模板對衣殼蛋白的基因片段進行擴增；并以Seg2-F，Seg2-R為引物，以pUC57-ORF2為模板對刺突蛋白的基因片段進行擴增。

3.根據權利要求1所述的高效表達鵝星狀病毒可溶性衣殼蛋白的ORF2基因的方法，其特征在于，所述方法還包括通過Ni-NTA層析柱對蛋白進行純化，操作步驟如下：(1)填裝鎳料：取10mL鎳填料裝填柱子中，用ddH₂O緩慢流過鎳柱，將20％乙醇溶液流出，反復灌柱清洗；(2)平衡鎳柱：20mL Binding Buffer平衡柱子；(3)樣品上樣：向鎳柱中分別加入10mLcap蛋白或spike蛋白，重復上樣3次；(4)洗滌蛋白：50mL Washing Buffer持續洗滌雜蛋白；(5)洗脫蛋白：10mL Elution Buffer洗脫目的蛋白。