[發明專利]外泌體RNA的高通量測序文庫的構建方法及裝置、用途

在審

• 申請號: 202010336574.1
• 申請日: 2020-04-24
• 公開（公告）號: CN111501106A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 楊玲;管彥芳;張燕艷;姬利延;賈明璽
• 申請（專利權）人: 北京吉因加科技有限公司;北京吉因加醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C40B60/08;C12Q1/6869;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 成珊

本發明公開了一種外泌體RNA的高通量測序文庫的構建方法，包括：提取外泌體的總RNA；將總RNA進行片段化處理，得到片段化的RNA；將片段化的RNA逆轉錄為雙鏈cDNA；在雙鏈cDNA的5’端和3’端連接測序接頭，得到接頭連接產物；PCR擴增接頭連接產物，得到富集的接頭連接產物；從富集的接頭連接產物中分離單鏈DNA，將單鏈DNA進行環化處理，獲得環狀DNA，環狀DNA構成外泌體RNA的高通量測序文庫。上述構建方法能夠實現對低起始量的外泌體RNA的測序文庫的構建，測序結果廣泛覆蓋mRNA、miRNA、lncRNA等各類RNA，在疾病早期診斷、預后評估、療效監測及治療方法研究等方面具有重要價值。

技術領域

本發明涉及高通量測序技術領域，具體涉及一種外泌體RNA的高通量測序文庫的構建方法及裝置、用途。

背景技術

外泌體(exosome)是一類脂質雙分子層的封閉性膜囊泡，直徑為30-150nm，密度為1.10-1.21ng/ml，具有來源細胞的胞質和膜成分。外泌體最早在在成熟哺乳動物的網織紅細胞成熟過程中觀察，此后的研究中發現肥大細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、間充質干細胞及腫瘤細胞等大部分細胞系都可以產生并釋放外泌體。外泌體作為由胞內體(endosome)衍生出的多囊泡體(multi vesicular bodies，MVBs)，廣泛的參與了各種細胞的病理生理過程。外泌體內包裹有蛋白、核酸和脂質等多種成分，其中，RNA(mRNA、ncRNA)富集于外泌體內，受外泌體表面膜的保護具有很好的穩定性，是反應特定生理或病理狀態的理想生物分子。

轉錄組測序(RNA sequencing，RNA-Seq)技術是深入研究RNA功能及表達變化的重要工具，能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測。目前，在以RNA-Seq分析外泌體RNA的研究中，主要是基于mRNA及miRNA構建相應的mRNA測序文庫和miRNA測序文庫。在構建上述測序文庫時，需要以oligo(dT)捕獲技術或設計探針以特異性去除外泌體總RNA中的核糖體RNA(rRNA)。然而，由于外泌體RNA integrity Number(RIN)范圍為1～3，且含量低?，F有外泌體RNA測序文庫的構建方法會對RNA量造成較大損失，通常需要較高起始量的RNA(至少10ng)以滿足建庫的要求；此外，受文庫構建過程中RNA損失的影響，使RNA-Seq難以廣泛覆蓋外泌體中的各類RNA，限制了外泌體RNA在臨床診斷、生物醫學研究等方面的應用。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題在于克服現有技術中的構建外泌體RNA測序文庫需要的RNA起始量高，且難以廣泛覆蓋各外泌體RNA的缺陷。

為此，本發明提供如下技術方案：

第一方面，本發明提供一種外泌體RNA的高通量測序文庫的構建方法，包括以下步驟：

S1，提取外泌體的總RNA；

S2，將所述總RNA進行片段化處理，得到片段化的RNA；

S3，將所述片段化的RNA逆轉錄為雙鏈cDNA；

S4，在所述雙鏈cDNA的5’端和3’端連接測序接頭，得到接頭連接產物；PCR擴增所述接頭連接產物，得到富集的接頭連接產物；

S5，從所述富集的接頭連接產物中分離單鏈DNA，將所述單鏈DNA進行環化處理，獲得環狀DNA，所述環狀DNA構成所述外泌體RNA的高通量測序文庫。

可選地，上述的構建方法，所述步驟S3包括：

S31，將所述片段化的RNA逆轉錄為雙鏈cDNA；

S32，采用磁珠對所述雙鏈cDNA進行純化處理，得到純化的雙鏈cDNA；

S33，對所述純化的雙鏈cDNA進行末端修復，同時在所述純化的雙鏈cDNA的5’端和3’端添加堿基A，得到末端修復的雙鏈cDNA；