[發明專利]外泌體RNA的高通量測序文庫的構建方法及裝置、用途

在審

• 申請號: 202010336574.1
• 申請日: 2020-04-24
• 公開（公告）號: CN111501106A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 楊玲;管彥芳;張燕艷;姬利延;賈明璽
• 申請（專利權）人: 北京吉因加科技有限公司;北京吉因加醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C40B60/08;C12Q1/6869;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 成珊

1.一種外泌體RNA的高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，提取外泌體的總RNA；

S2，將所述總RNA進行片段化處理，得到片段化的RNA；

S3，將所述片段化的RNA逆轉錄為雙鏈cDNA；

S4，在所述雙鏈cDNA的5’端和3’端連接測序接頭，得到接頭連接產物；PCR擴增所述接頭連接產物，得到富集的接頭連接產物；

S5，從所述富集的接頭連接產物中分離單鏈DNA，將所述單鏈DNA進行環化處理，獲得環狀DNA，所述環狀DNA構成所述外泌體RNA的高通量測序文庫。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟S3包括：

S31，將所述片段化的RNA逆轉錄為雙鏈cDNA；

S32，采用磁珠對所述雙鏈cDNA進行純化處理，得到純化的雙鏈cDNA；

S33，對所述純化的雙鏈cDNA進行末端修復，同時在所述純化的雙鏈cDNA的5’端和3’端添加堿基A，得到末端修復的雙鏈cDNA。

3.根據權利要求1或2所述的構建方法，其特征在于，所述步驟S4包括：

S41，在所述雙鏈cDNA的5’端和3’端連接測序接頭，得到接頭連接產物；

S42，采用磁珠對所述接頭連接產物進行純化處理，獲得純化的接頭連接產物；

S43，對所述純化的接頭連接產物進行PCR擴增，得到所述富集的接頭連接產物；

S44，采用磁珠對所述富集的接頭連接產物進行純化處理，得到適于分離單鏈DNA的接頭連接產物。

4.根據權利要求1-3任一項所述的構建方法，其特征在于，所述總RNA包括：mRNA，miRNA，lncRNA，snRNA，snoRNA。

5.根據權利要求1-4任一項所述的構建方法，其特征在于，所述測序接頭是由第一序列和第二序列部分互補形成的Y型接頭，所述第一序列是核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的單鏈核苷酸，所述第二序列是核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的單鏈核苷酸；

所述PCR擴增的引物包括：forward primer，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；reverse primer，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根據權利要求1-5任一項所述的構建方法，其特征在于，

所述總RNA進行片段化處理的反應溶液包括：總RNA 5μL；NEB Next First StrandSynthesis Reaction Buffer 4μL；Random Primers 1μL；

所述總RNA進行片段化處理的反應程序為：94℃反應7min；

所述片段化的RNA逆轉錄為雙鏈cDNA包括第一鏈合成反應和第二鏈合成反應；

所述第一鏈合成反應的反應體系包括：含有片段化的RNA的反應溶液，10μL；Nuclease-free Water，8μL；NEB Next First Strand Synthesis Enzyme Mix，2μL；

所述第一鏈合成反應的反應程序包括：25℃反應10min，42℃反應15min，70℃反應15min，4℃保持；

所述第二鏈合成反應的反應體系包括：含有第一鏈的反應溶液，20μL；NEB NextSecond Strand Synthesis Reaction Buffer(10X)，8μL；NEB Next Second StrandSynthesis Enzyme Mix，4μL；Nuclease-free Water，48μL；

所述第二鏈合成反應的反應程序包括：16℃反應1h。