[發明專利]一種鑒定云蘿卜2號雜交種子純度的SSR引物及方法

有效

• 申請號: 202010331128.1
• 申請日: 2020-04-24
• 公開（公告）號: CN111349716B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 陶婧;李石開;孫一丁;汪騫;袁藝;鐘秋月
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院園藝作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 53216
• 代理人: 胡亞蘭

1.一種利用SSR引物鑒定云蘿卜2號雜交種子純度的方法，其特征在于，所述SSR引物為SSR06，包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:2；

所示所述方法包括：

步驟1，采用CTAB法提取云蘿卜2號父本材料WR01、母本材料WS01，雜交種F₁的葉片基因組DNA；

步驟2，以步驟1所提取的云蘿卜2號雜交種基因組DNA作為模板，采用所述SSR引物SSR06進行PCR擴增；

步驟3，將步驟2中的擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法染色，照相并統計結果；比較云蘿卜2號雜交種及其雙親的特征譜帶，表現共顯性互補帶型為云蘿卜2號雜交種，只有親本帶型的為非雜交種，出現其他第三種帶型的為外來雜種;

步驟4，利用步驟3的統計結果計算云蘿卜2號雜交種的純度。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3擴增產物的檢測包括：

步驟i，將步驟2的擴增產物中加入2 μL上樣緩沖液，經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，每個樣孔點2 μL，DL50 DNA Marker 為對照，恒壓下電泳一段時間；

步驟ii，電泳結束后，將凝膠剝下在固定液中浸泡一段時間后取出用雙氧水沖洗一次，在0.1% AgNO₃溶液中銀染一段時間后取出用雙氧水快速沖洗數次，隨后浸泡在于顯影液進行顯影，直至可以觀察到DNA條帶；

步驟iii，立即用雙氧水漂洗，平鋪放在觀察燈上統計帶型并拍照編號保存。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述云蘿卜2號雜交種的純度是通過以下方式進行計算的：

送檢測云蘿卜2號純度（%）=（總檢測種子粒數-非雜交種數-外來雜交種數）/總檢測種子粒數×100%。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中PCR擴增時，反應體系包括: 10 μL 2×Taq plus master mixII，7 μL ddH20，1 μL模板DNA ，上游引物SSR06-F和下游引物SSR06-R各1 μL。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2中PCR擴增時的PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min ；30個擴增循環，95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min 25 s；72 ℃延伸 5 min。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中提取云蘿卜2號父本材料WR01、母本材料WS01，雜交種F₁的葉片基因組DNA的步驟包括：

步驟a，取幼嫩葉片放入離心管中，加入液氮用研磨棒研磨，加CTAB提取緩沖液，研磨，后補齊至一定體積，水浴；

步驟b，加入V氯仿：V異戊醇=24:1，輕搖，后離心；

步驟c，取上清，加入預冷的異丙醇混勻，冷藏；冷藏后離心；棄上清，加入預冷乙醇，輕輕混勻洗凈，離心；棄上清，晾干或吹干；

步驟d，加TE溶解DNA，室溫放置；

步驟e，用TE將DNA稀釋后作為PCR模板使用或冷藏保存備用。

7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定液為0.02% 冰醋酸和99% 酒精混合液。

8.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述顯影液為3% NaOH與0.5% 甲醛混合液。