[發(fā)明專利]一種用于稻田土壤中擬禾本科根結(jié)線蟲qPCR定量檢測的引物組合物、試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010330866.4
• 申請日: 2020-04-24
• 公開（公告）號: CN111363832A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 成飛雪;王東偉;劉勇;張德詠;王劍;何清聰;唐蓓
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南省植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 張煥響

1.一種用于稻田土壤中擬禾本科根結(jié)線蟲qPCR檢測的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

2.一種用于稻田土壤中擬禾本科根結(jié)線蟲qPCR檢測的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物組合物及SYBR Premix Ex Taq。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照品和陰性對照品。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品包括擬禾本科根結(jié)線蟲基因組DNA；所述陰性對照品包括滅菌ddH₂O。

5.一種權(quán)利要求2-3任一項所述的試劑盒在檢測寄主根圍土壤中擬禾本科根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用方法，包括以下步驟：

(1)提取待檢樣品的土壤DNA；

(2)以待檢樣品的土壤DNA為模板，利用所述試劑盒進行qPCR擴增反應(yīng)，收集熒光數(shù)據(jù)；

(3)分析所述熒光數(shù)據(jù)的Ct值和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果來判斷是否存在擬禾本科根結(jié)線蟲；當(dāng)Ct值36或顯示N/A，且無明顯的擴增曲線，則表示待測樣品中不含擬禾本科根結(jié)線蟲；當(dāng)29.708＜Ct值≤36，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，則根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果條帶有無來判斷是否存在擬禾本科根結(jié)線蟲；當(dāng)Ct值≤29.708，且有明顯的擴增曲線，則表示待測樣品中含有擬禾本科根結(jié)線蟲；

(4)當(dāng)Ct值≤29.708時，按照公式(Ⅰ)計算待測樣品中擬禾本科根結(jié)線蟲數(shù)量X，所述擬禾本科根結(jié)線蟲數(shù)量X的單位為條；

X＝10^{(29.708-Ct值)/3.146} (Ⅰ)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述qPCR擴增反應(yīng)體系為20μL，包括：待測樣品基因組DNA1μL，上游引物0.4μL(濃度10μM)，下游引物0.4μL(濃度10μM)，SYBR Premix Ex Taq 10μL，滅菌ddH₂O 8.2μL。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述qPCR擴增反應(yīng)的程序為：95℃30s，[95℃5s、64℃30s，39個循環(huán)]，72℃30s，反應(yīng)結(jié)束。