[發明專利]一種用于稻田土壤中擬禾本科根結線蟲qPCR定量檢測的引物組合物、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202010330866.4
• 申請日: 2020-04-24
• 公開（公告）號: CN111363832A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 成飛雪;王東偉;劉勇;張德詠;王劍;何清聰;唐蓓
• 申請（專利權）人: 湖南省植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 張煥響

本發明公開了一種用于稻田土壤中擬禾本科根結線蟲qPCR定量檢測的引物組合物、試劑盒及其應用，屬于分子生物學檢測技術領域，所述引物組包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；本發明的引物組能夠擴增出一條大小為87bp的特異性條帶，用于稻田土壤中擬禾本科根結線蟲特異性定量檢測，其靈敏度比普通PCR檢測高100倍；本發明中用于擬禾本科根結線蟲qPCR定量檢測的引物組合物適用于用于稻田土壤中擬禾本科根結線蟲qPCR定量檢測，具有高靈敏度，對待測樣品要求較低等優勢。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，特別是涉及一種用于稻田土壤中擬禾本科根結線蟲qPCR定量檢測的引物組合物、試劑盒及其應用。

背景技術

植物寄生線蟲是水稻生產上的重要病原物，其中危害最為嚴重的是擬禾本科根結線蟲(Meloidogyne graminicola)。該線蟲是水稻上重要的內寄生線蟲，廣泛分布于南亞、東南亞、非洲、美洲和歐洲等國家的水稻產區，引起水稻根結線蟲病(Rice Root-KnotDisease)，通常造成水稻減產11％至 80％(Mantelin et al.，2017)，甚至達100％，嚴重影響水稻產業的穩定發展。近年來，隨著國內耕作模式的改變，特別是直播水稻田面積的逐年增加，由擬禾本科根結線蟲引起的水稻根結線蟲病擴散蔓延迅速，危害越來越嚴重。2016年至2019年，我國的湖南、湖北、江西、江蘇、海南、廣西等多地水稻根結線蟲病嚴重發生，引起水稻大面積減產。擬禾本科根結線蟲寄主范圍廣，危害隱蔽，防治極其困難。目前常用的低毒殺線蟲劑大多用于旱地作物線蟲病害的防治，而能直接用于水田根結線蟲病害防控的安全有效、且低成本的防治措施非常有限。特別是作物定植之后再進行水稻根結線蟲病害防治尤其困難。所以，開展稻田土壤樣品中擬禾本科根結線蟲病原快速、定量檢測，對水稻根結線蟲病的早期預警和實施有效防控措施具有極其重要的意義。

目前，擬禾本科根結線蟲病原鑒定和檢測方法主要包括傳統的形態學分離鑒定和以及PCR檢測鑒定(Htay et al.,2016)。但是傳統的形態學分離鑒定或PCR檢測鑒定都需要將線蟲從待檢測的土壤樣品中進行分離和在顯微鏡下進行初步的形態學觀察及挑取線蟲等過程，既費時費力，又需要操作人員具備專業的技能和豐富的經驗，不能滿足快速檢測的需要。

qPCR檢測鑒定技術通過提取土壤中生物總DNA，快速有效檢測土壤 DNA中擬禾本科根結線蟲，并能定量檢測土壤中擬禾本科根結線蟲的種群密度，為擬禾本科根結線蟲的早期預警和制定有效防控措施提供技術支撐。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于稻田土壤中擬禾本科根結線蟲qPCR定量檢測的引物組合物、試劑盒及其應用，試劑盒用于擬禾本科根結線蟲的 qPCR定量檢測，具有特異性強，靈敏度高、操作簡單的特點。對待檢樣品要求低，可直接應用于土壤中擬禾本科根結線蟲的檢測。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種用于稻田土壤中擬禾本科根結線蟲qPCR檢測的引物組合物，所述引物組合物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本發明還提供一種用于稻田土壤中擬禾本科根結線蟲qPCR檢測的試劑盒，包括上述的引物組合物及SYBR Premix Ex Taq。

進一步地，所述試劑盒還包括陽性對照品和陰性對照品。

進一步地，所述陽性對照品包括擬禾本科根結線蟲基因組DNA；所述陰性對照品包括滅菌ddH₂O。

本發明還提供一種上述的試劑盒在檢測寄主根圍土壤中擬禾本科根結線蟲中的應用。