[發明專利]一種用于鐘器腐霉的LAMP檢測引物組合物、檢測試劑盒及其可視化檢測方法

在審

• 申請號: 202010330834.4
• 申請日: 2020-04-24
• 公開（公告）號: CN111534626A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 高春生;余永廷;紀灝君;王吐虹;李智敏;陳佳;程毅;郭利桃;聶純武;文傳如
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院麻類研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種用于鐘器腐霉的LAMP檢測引物組合物、檢測試劑盒及其可視化檢測方法，提取待檢測微生物的基因組DNA，取基因組DNA溶液作為反應模板，加入LAMP試劑盒中的檢測溶液進行LAMP反應，所述LAMP反應的程序為：64℃反應擴增60min，然后觀察擴增產物的顏色變化，如果顏色由紫色變為藍色，表示待檢物中存在鐘器腐霉，如果顏色沒有變化仍是紫色，表示待檢物中不存在鐘器腐霉。與傳統的依靠形態和分子PCR檢測技術相比，本發明具備更高的準確性、靈敏性和實效性，而且操作簡單。可用于鐘器腐霉的快速檢測，為監測和防治鐘器腐霉引起的病害提供技術支撐。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種用于鐘器腐霉的LAMP檢測引物組合物、檢測試劑盒及其可視化檢測方法。

背景技術

鐘器腐霉(Phytopythium vexans)作為卵菌的一種重要病原菌，能侵染煙草，柑橘，苧麻等多種重要的經濟作物。苧麻是蕁麻科苧麻屬的一種多年生草本植物，原產于東亞，是世界上最古老的纖維作物之一，具有很高的經濟價值。以鐘器腐霉為主引起的根褐腐病是近年來發現的一種新的苧麻根部的毀滅性病害，該病害在多個苧麻主產區均有發生，且危害嚴重，生產上需要一種能夠在苧麻發病早期快速、準確鑒定該病原菌的方法。目前對鐘器腐霉菌的鑒定方法主要是通過培養病原菌及觀察鑒定，但由于腐霉菌的分離培養較難，近緣種之間的菌絲,孢子囊及卵孢子形態極為相似，且引起的病害癥狀與其他植物病害較像，難以分辨，致使對該菌的鑒定十分困難。由此可見，傳統的鑒定方法需要豐富的病原菌形態識別知識與經驗，不僅耗時長，而且難以判斷準確性，不利于大容量樣本的分析鑒定,無法滿足田間生產上的需求。隨著分子生物學的發展，以聚合酶鏈式反應(PCR)和實時熒光定量PCR 為主的多種檢測技術已被開發和廣泛應用，并已成為快速、準確、特異性地鑒定病原菌的主要手段，避免了形態學鑒定不確定性的缺點。但是這些檢測技術往往需要在具有專業儀器、試劑和嚴格環境條件的實驗室中進行，儀器和試劑的價格昂貴且操作要求較高，過程復雜，檢測時間仍然較長，這些缺點使之不適宜在基層環境中使用。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種新開發的分子檢測技術，它使用4條特異性引物，利用具有鏈置換活性的 Bst DNA聚合酶實現恒溫條件下對目標DNA的短期內大量擴增。LAMP技術的檢測結果有多種檢驗方式，在高效擴增條件下，從脫氧核酸三磷酸基質 (dNTPs)中析出的焦磷酸離子與體系中的鎂離子結合可產生大量焦磷酸鎂，從而出現白色沉淀，因此可通過濁度儀監測其擴增產物；也可以通過凝膠電泳進行檢測，或在反應體系中加入熒光染料鈣黃綠素或羥基萘酚藍(HNB) 等，根據體系顏色變化，用肉眼就可觀察判斷檢測結果。這種方法不需要專業的儀器和復雜的程序，并且具有操作簡單、快速高效、特異性強、靈敏度高等優點，是一種適合于基層使用的快速檢測技術。LAMP技術已廣泛應用于真菌、細菌、病毒和線蟲等多種病原物的快速檢測,但關于鐘器腐霉的LAMP 快速檢測方法，國內外均尚未報道。

鑒于此，本發明以ITS序列為檢測的靶標序列，設計了鐘器腐霉特異性的 LAMP引物，并在此基礎上建立了鐘器腐霉的LAMP快速檢測方法。

發明內容

針對現有技術中鐘器腐霉生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差、靈敏度低的問題，本發明的目的是提供一種用于鐘器腐霉的LAMP檢測引物組合物、試劑盒及其可視化檢測方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

一種用于鐘器腐霉的LAMP檢測引物組合物，該引物組合物包含:如SEQ ID NO：1所示的正向外引物F3,如SEQ ID NO：2所示的反向外引物B3,如 SEQ ID NO：3所示的正向內引物FI,如SEQ ID NO：4所示的反向內引物BIP。

本發明還提供了一種用于鐘器腐霉的LAMP檢測試劑盒，LAMP檢測試劑包括上述LAMP檢測引物組合物。