[發明專利]一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT-RAA檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010329573.4
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111424117A
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 李世波;付永鋒;王秋景;程訓佳;周晶雨;戚婉君;朱立君;張浙恩
• 申請（專利權）人: 舟山醫院;復旦大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;何俊

本發明涉及病毒檢測技術領域，公開了一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT?RAA檢測試劑盒，包括：上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示；探針，序列如SEQ ID NO:3所示。本發明的試劑盒具有98.39%的正確率，特異度達98.95%，每反應檢測靈敏度在95%的概率下達到241copies/反應，可實現在39℃等溫條件下25分鐘內完成新型布尼亞病毒的檢測，具有操作簡便、快速、靈敏、適用于現場快速檢測的特點。

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，尤其涉及一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT-RAA檢測體系。

背景技術

發熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是一種由新型布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTSV)感染引起的嚴重的傳染性疾病，臨床表現主要有發熱、血小板減少、白細胞減少、胃腸道癥狀和肝功能異常，病死率高達6.4-30％。SFTSV屬于布尼亞病毒科(Banyangvirus)，白蛉病毒屬(Phenuiviridae)，可感染人、動物和蜱等多種宿主，目前認為長角牛蜱是主要的傳播載體。我國的流行地區主要為東部、中部省份的山地、丘陵地區。自2009年SFTSV在我國被首次分離鑒定后，我國的 SFTS病例數逐年上升，在韓國、日本、美國等全世界多個國家也相繼有病例被報道。近年多項研究發現SFTS可通過密切接觸或氣溶膠進行人間傳播。因此，SFTS已成為一個嚴重的公共衛生問題。

現階段對SFTSV的實驗室檢測方法主要病毒分離鑒定、血清抗體檢測和病毒核酸檢測。

病毒分離鑒定：需要采集早期SFTS患者急性期血清標本，體外接種Vero E6細胞，通過顯微鏡或分子生物學手段對接種效果進行確認。分離得到SFTSV是診斷SFTS最有力的病原學證據，但相關實驗操作須專業技術人員在III級生物安全實驗室進行，且耗時1-2周，不適用于臨床實驗室檢測和現場快速檢測。

血清抗體檢測：通過血清中和試驗或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測患者血清中的新型布尼亞病毒IgM、IgG抗體。血清中和試驗耗時較長，且成本較高，不常用于臨床實驗室檢測。ELISA檢測抗體的敏感度較高，操作較為簡便、快速。但是對新型布尼亞病毒IgM抗體的研究發現部分患者急性期IgM抗體可呈陰性，恢復期轉陽；而對IgG抗體的檢測需要患者急性期、恢復期雙份血清標本，不適用于現場快速檢測。

病毒核酸檢測：目前已有多種檢測患者血清中SFTSV RNA的方法，臨床常用的包括逆轉錄PCR(RT-PCR)、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)、逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)等方法，均具有高靈敏度和特異度。基于PCR的檢測通常需要精密昂貴的儀器和專業檢測人員來避免污染對檢測結果的影響；RT-LAMP敏感性很高，但需要4-6條引物，增加了引物設計的難度和復雜性，且存在一定的假陽性率，影響其作為現場診斷技術的應用。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT-RAA檢測試劑盒，具有98.39％的正確率，特異度達98.95％，每反應檢測靈敏度在95％的概率下達到241copies/反應，可實現在39℃等溫條件下25分鐘內完成新型布尼亞病毒的檢測，具有操作簡便、快速、靈敏、適用于現場快速檢測的特點。

本發明的具體技術方案為：

第一方面，本發明提供了一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT-RAA檢測特異性引物，包括：

上游引物，序列如SEQ ID NO：1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；