[發明專利]一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT-RAA檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010329573.4
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111424117A
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 李世波;付永鋒;王秋景;程訓佳;周晶雨;戚婉君;朱立君;張浙恩
• 申請（專利權）人: 舟山醫院;復旦大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;何俊

1.一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT-RAA檢測特異性引物，其特征在于包括：

上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；

下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC。

2.一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT-RAA檢測探針，其特征在于，序列如SEQ ID NO:3所示：AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3 Spacer]；

其中，dT-FAM為連接FAM熒光基團的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer為四氫呋喃殘基，dT-BHQ1為連接BHQ1熒光淬滅基團的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer為3‘端間臂。

3.一種用于新型布尼亞病毒核酸現場快速檢測的實時熒光RT-RAA檢測試劑盒，其特征在于包括：

上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；

下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC；

探針，序列如SEQ ID NO:3所示：

AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3 Spacer]；其中，dT-FAM為連接FAM熒光基團的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer為四氫呋喃殘基，dT-BHQ1為連接BHQ1熒光淬滅基團的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer為3‘端間臂。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括：

無RNA酶的水；

酶粉；

RNA模板；

醋酸鎂溶液。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，以總體積為20μL計，試劑盒中各組分的含量如下：

上游引物0.75-1μL，8-12μmol/L；

下游引物0.75-1μL，8-12μmol/L；

探針1-1.4μL，0.4-0.6μmol/L；

反應緩沖液8-12 μL；

無RNA酶的水1.12-5.12 μL；

酶粉0.3-0.5個反應單元；

RNA模板1-5μL；

醋酸鎂溶液0.8-1.2μL，260-300mmol/L。

6.如權利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述酶粉由UvsX重組酶、單鏈DNA結合蛋白和擴增酶組成。

7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，以總體積為20μL計，試劑盒中各組分的含量如下：

上游引物0.84μL，10μmol/L；

下游引物0.84μL，10μmol/L；

探針1.2μL，0.5μmol/L；

反應緩沖液10μL；

無RNA酶的水4.12μL；

酶粉0.4個反應單元；

RNA模板2μL；

醋酸鎂溶液1μL，280mmol/L。

8.一種如權利要求3-7之一所述試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟：將試劑盒中的組分配制混合后置于反應管中，將所述反應管置于7500 Real-Time PCR熒光檢測儀中，37-41℃反應20-30min，于激發波長488nm，發射波長520nm的FAM通道每28-32s采集1次熒光值；反應結束后，記錄檢測樣本的閾值時間，即樣本熒光值超過熒光閾值所需的時間。

9.如權利要求8的使用方法，其特征在于，所述熒光閾值為根據陰性對照-無RNA酶的水的熒光強度均值及其3倍標準差確定。