[發明專利]一種制備固定化精氨酸脫亞胺酶及生產[14/15

有效

• 申請號: 202010328248.6
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111394295B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 黃鋼;李斌;李玥
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12N15/66;C12N9/78;C07K19/00;C12N1/20;C12P21/02;C12P13/10;C12R1/15
• 代理公司: 廣東德而賽律師事務所 44322
• 代理人: 葉秀進

本申請公開了一種制備固定化精氨酸脫亞胺酶及生產[^14/15N]?L?瓜氨酸的方法，所述基因工程菌中表達精氨酸脫亞胺酶。本申請還公開了一種由cipA?arc表達的融合蛋白及其制備方法。本申請公開的含cipA?精氨酸脫亞胺酶的基因工程菌和由cipA?arc表達的cipA?arc融合蛋白均可用于轉化[^14/15N]?L?精氨酸生產[^14/15N]?L?瓜氨酸。本申請還提供了一種[^14/15N]?L?瓜氨酸的酶催化制備新方法。該方法產物后處理簡單，操作方便，易于放大生產，酶蛋白可重復利用，生產成本低。

技術領域

本申請涉及一種生物催化制備[^14/15N]-L-瓜氨酸的方法，屬于生物制藥和生物化工技術領域。

背景技術

瓜氨酸是一種α-氨基酸，因最先從西瓜中獲取，而得名瓜氨酸。L-瓜氨酸能提高體內一氧化氮的含量，一氧化氮可舒緩動脈，促進全身血液流動從而更好的工作。瓜氨酸對防治前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺腫脹、前列腺肥大等作用明顯。最近研究表明，瓜氨酸在體內轉化為人體必需氨基酸L-精氨酸。精氨酸缺乏可導致一系列的心血管疾病，包括高血壓、動脈粥樣硬化、心衰等。由于L-瓜氨酸作為合成L-精氨酸的前體，在許多組織中能轉化成L-精氨酸，且在胃腸道和肝臟中不代謝，亦不誘導精氨酸酶活性升高，因此補充L-瓜氨酸能輔助治療精氨酸缺乏引起的相關疾病。瓜氨酸有較強的抗氧化能力，能夠清除自由基，可有效保護DNA免受氧化反應的侵害，可以作為抗衰老、提高免疫力的保健品，也可作為美容化妝品，具有護膚防皺祛斑之功效。服用瓜氨酸能有效的改善人體的抗疲勞能力，維護健康的心肺功能，提高腦力清晰度，降低壓力和克服沮喪情緒，平衡血糖濃度，增強人體的肌肉強度，在運動保健方面具有良好的作用。

目前，瓜氨酸常用的生產方法主要有化學合成法、提取法、發酵法、酶轉化法等。化學法是在堿性條件下水解精氨酸獲得瓜氨酸，存在工藝難以精確控制，產物屬于非單一構型，含有D-瓜氨酸，影響質量，產生的廢水影響環境。專利CN105483060中通過發酵法生產瓜氨酸，主要采用誘變選育的方法，存在生產菌株隨機性大，很難得到高產菌種。天然產物中瓜氨酸含量較低，原料來源受限，生產規模小，工藝復雜，產率低。專利CN104805144采用酶轉化法合成瓜氨酸，工藝簡單。但是使用的菌種為大腸桿菌，存在革蘭氏陰性菌共同的缺點就是含有內毒素，限制其在食品或化妝品中的應用。

固定化酶的制備方法有物理法和化學法兩大類。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的優點在于酶不參加化學反應，整體結構保持不變，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空間或立體阻礙作用，因此對一些反應不適用。化學法包括結合法、交聯法。化學法酶與載體之間結合緊密，不易脫落，穩定性好，但反應條件激烈，操作復雜，控制條件苛刻，活力損失較大。

發明內容

根據本申請的第一方面，提供了一種含精氨酸脫亞胺酶的基因工程菌，所述基因工程菌中表達精氨酸脫亞胺酶。具體的，所述基因工程菌中，在谷氨酸棒桿菌中表達出精氨酸脫亞胺酶，所述的基因工程菌保藏名稱為谷氨酸棒桿菌SUMHS-2020.01，分類命名為Corynebacterium glutamicum，該菌株已于2020年1月17日保藏于中國北京市朝陽區北辰西路1 號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏中心的保藏編號為CGMCC No.19404。

所述基因工程菌由以下步驟制備：

(1)將cipA基因序列在DNA5’端引入HindIII位點，3’端引入SalI位點，得到基因序列為SEQ ID NO.1的片段，合成的片段經過測序后，用HindIII/SalI雙酶切目標基因和表達載體 pXMJ19，酶切產物經過凝膠回收后，將目標片段和載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞，獲得陽性轉化子pXMJ19-cipA；