[發明專利]一種制備固定化精氨酸脫亞胺酶及生產[14/15

有效

• 申請號: 202010328248.6
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111394295B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 黃鋼;李斌;李玥
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12N15/66;C12N9/78;C07K19/00;C12N1/20;C12P21/02;C12P13/10;C12R1/15
• 代理公司: 廣東德而賽律師事務所 44322
• 代理人: 葉秀進

1.一種cipA-arc融合蛋白，其特征在于，精氨酸脫亞胺酶arc固定于包涵體蛋白cipA上，產生具有催化活性的包涵體蛋白cipA-arc即cipA-arc融合蛋白，所述cipA-arc融合蛋白的制備包括以下步驟：

(1)制備谷氨酸棒桿菌感受態細胞；

(2)采用含精氨酸脫亞胺酶的基因工程菌pXMJ19-cipA-arc電擊轉化步驟(1)所述的谷氨酸棒桿菌感受態細胞，得到重組菌；

含精氨酸脫亞胺酶的基因工程菌pXMJ19-cipA-arc的構建方法如下：

將序列為SEQ ID NO.1的cipA基因在DNA5’端引入HindIII位點，3’端引入SalI位點，合成的片段經過測序后，用HindIII/SalI雙酶切目標基因和表達載體pXMJ19，酶切產物經過凝膠回收后，將目標片段和載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得陽性轉化子表達載體pXMJ19-cipA；將序列為SEQ ID NO.2的精氨酸脫亞胺酶arc基因在DNA5’端引入XhoI位點，3’端引入SacI位點，合成的片段經過測序后，用XhoI/SacI雙酶切目標基因和表達載體pXMJ19-cipA，酶切產物經過凝膠回收后，將目標片段和載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得陽性轉化子重組質粒pXMJ19-cipA-arc，即為含精氨酸脫亞胺酶的基因工程菌，所述重組質粒pXMJ19-cipA-arc電擊轉化感受態細胞采用如下制備方法：

取谷氨酸棒桿菌感受態細胞和重組質粒pXMJ19-cipA-arc混勻，冰上冷卻后，在相同溫度條件下，以電擊條件為電壓2.5kV，電擊5ms；再在室溫下加入LBG液體培養基，轉移到離心管中，經振蕩培養后取所得液體涂布于含氯霉素抗性平板，挑選單菌落提取質粒，再通過雙酶切、PCR確認目的片段的插入，得到的重組菌接種；

(3)將步驟(2)所述得到的重組菌經基因工程菌誘導表達得到的重組菌體全細胞，經超聲破碎、離心后，所得的沉淀即為cipA-arc融合蛋白。

2.根據權利要求1所述的cipA-arc融合蛋白，其特征在于，所述基因工程菌中，在谷氨酸棒桿菌中表達出精氨酸脫亞胺酶，所述的基因工程菌保藏名稱為谷氨酸棒桿菌SUMHS-2020.01，分類命名為Corynebacterium glutamicum，該菌株已于2020年1月17日保藏于中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏中心的保藏編號為CGMCC No.19404。

3.根據權利要求1所述的cipA-arc融合蛋白，其特征在于，所述谷氨酸棒桿菌感受態細胞采用如下制備方法：

將谷氨酸棒桿菌ATCC13032在含LBG固體培養基中培養后，挑取新鮮菌株接種于LBG液體培養基中，經培養后按0.8-1.5％的接種量將活化菌液轉接至LBG培養基中，繼續培養至OD600為0.8-1.0；將菌液經冰水混合物預冷、離心，吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌體懸浮，再次經離心、吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌體懸浮，即可得到谷氨酸棒桿菌感受態細胞。

4.根據權利要求1所述的cipA-arc融合蛋白，其特征在于，所述基因工程菌的誘導表達方法如下：

將重組菌接種于含氯霉素的LBG培養基中，經搖床培養至菌體OD600值達到0.8-1.0時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，經誘導過夜后離心收集得到重組菌體全細胞，用Tris-HCl緩沖液洗滌菌體后重懸于磷酸緩沖液，超聲破碎細胞后再次離心，沉淀即為獲得的cipA-arc融合蛋白。

5.一種酶催化[^14/15N]-L-瓜氨酸的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

取權利要求1-4任一項所述的cipA-arc融合蛋白投入轉化液中進行反應；

所述反應的條件：所述的轉化液中包含[^14/15N]-L-精氨酸和緩沖溶液，轉化溫度為25-50℃，pH為5.0-8.0，轉化時間2-8h。

6.根據權利要求5所述的酶催化[^14/15N]-L-瓜氨酸的制備方法，其特征在于，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液，所述轉化溫度為37℃；所述pH為6.5；所述轉化時間為5h。