[發明專利]一種NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法

在審

• 申請號: 202010325101.1
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111593056A
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 張文娜;李曉軍
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京衛平智業專利代理事務所(普通合伙) 11392
• 代理人: 張新利;謝建玲

本發明提供了一種NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法，包括如下步驟：(1)、黃瓜與南瓜進行自嫁接及黃瓜/南瓜、南瓜/黃瓜進行異嫁接；(2)、分析黃瓜NAC2基因的核苷酸序列，尋找與南瓜同源基因的差異片段，設計黃瓜NAC2基因的特異性引物；(3)、用該引物對適溫生長及低溫處理組的自嫁接黃瓜、南瓜以及異嫁接黃瓜、南瓜進行PCR擴增，比較嫁接前后的PCR產物情況；(4)凝膠電泳檢測是否有正確的電泳條帶。本發明提供的方法快速、靈敏，準確性高，簡便，能夠應用于其他葫蘆科植物。

技術領域

本發明涉及植物分子生物學領域，具體涉及的是NAC2基因 mRNA分子在葫蘆科植物砧木和接穗間長距離傳遞的分子鑒定方法。

背景技術

嫁接是將植物體的芽或枝接到另一植物體的適當部位，使兩者接合形成一個新的植物體的技術。園藝領域中，嫁接常用來獲得抗性、矮化、優質等性狀，提高產品品質。大量研究表明，利用抗性砧木進行嫁接，可增強蔬菜嫁接苗根系吸收能力，并提高嫁接植株的抗逆性。

前人經過大量的研究發現，RNA作為一種信息分子，由細胞間和長距離的信息網絡介導其在嫁接植物砧穗之間運輸，從而調控植物生長發育及抗逆性相關能力。因此通過鑒定特定基因轉錄得出的 mRNA在黃瓜自異嫁接植株間的運輸情況，探究嫁接黃瓜砧穗間長距離mRNA分子調控機制。從而利用其調控黃瓜生長、品質性狀及提高冬春季節黃瓜產量，對于黃瓜越冬高效栽培生產具有重要意義。

最新研究顯示，嫁接園藝作物砧穗間存在大量的mRNA、小分子 RNA和蛋白質等信號分子，通過胞間連絲在相鄰的細胞間局部移動，進入韌皮部運輸，參與砧穗交流互作，調控轉錄、參與基因表達及蛋白翻譯，并調控器官生長發育及對逆境脅迫的適應性(Lucas etal.， 2001，Turgeon et al.，2009)。

迄今為止，研究發現，能在葫蘆科韌皮部進行長距離運輸的基因 mRNA及其編碼的蛋白質有很多。如免疫印跡分析結果表明，南瓜的蛋白質PP1和PP2從南瓜砧木中轉移，在黃瓜接穗中積累，定位于外韌皮部的篩分子和伴胞中，但在黃瓜中沒有檢測到南瓜PP1和PP2的mRNA信號，這表明PP蛋白質發生了長距離運輸(Golecki et al.，1999)。異種嫁接實驗證明，部分mRNA能從甜瓜砧木到南瓜接穗進行遠距離的轉移(Omid et al.，2007)。

NAC2編碼一個轉錄因子蛋白，在擬南芥中AtNAC2響應鹽脅迫，也可以被ABA和NAA誘導，其能夠促進或抑制下游基因，對擬南芥的側根發育起到調控作用(He et al.，2005)。在擬南芥中小麥 TaNAC2的過表達導致擬南芥對干旱，鹽和冷脅迫的耐受性增強(Mao etal.，2011)。這說明NAC2 mRNA的長距離運輸可能對嫁接植株的發育及抗性調控有潛在意義。

目前研究用來檢測植物韌皮部mRNA長距離運輸的方法有很多，如RNA-蛋白免疫共沉淀法(Ham et al.，2009)，巢式RT-PCR(Harada et al.,2009)，Northern雜交法等。這些方法雖然可以比較準確地檢測基因在韌皮部中的傳遞性，但其過程繁瑣，要求多，操作不易，增加了實驗難度。

發明內容

針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種NAC2 基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法。

為達到以上目的，本發明采取的技術方案是：

一種黃瓜NAC2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

黃瓜NAC2基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法，包括如下步驟：

(1)黃瓜與南瓜分別進行自嫁接；以黃瓜為接穗，南瓜為砧木進行嫁接；以南瓜為接穗，黃瓜為砧木進行嫁接，嫁接方式均為下胚軸嫁接；